高效液相色譜法對藍莓果實中8 個有機酸含量的測定

徐玉濤，李珂珂，王賀新，陳麗榮，弓曉杰，*

（1.大連大學醫學院，遼寧 大連 116622；2.大連大學現代化農業研究院，遼寧 大連 116622；3.大連大學環境與化學工程學院，遼寧 大連 116622）

高效液相色譜法對藍莓果實中8 個有機酸含量的測定

徐玉濤1，李珂珂1，王賀新2，陳麗榮3，弓曉杰1，*

（1.大連大學醫學院，遼寧 大連 116622；2.大連大學現代化農業研究院，遼寧 大連 116622；3.大連大學環境與化學工程學院，遼寧 大連 116622）

建立同時測定藍莓果實中8 個有機酸類成分含量的高效液相色譜法，并利用該方法測定26 個不同品種藍莓果實中的有機酸含量。結果表明，所測品種中塞拉的有機酸含量最高，達25.135 26 mg/g鮮果，最低的為克瑞頓，僅含2.368 31 mg/g鮮果。該方法簡便、快速、準確，具有良好的重復性和回收率，可作為藍莓果實中有機酸含量的測定方法。

藍莓；有機酸；檸檬酸；高效液相色譜；含量測定

藍莓，又名藍漿果、越橘，為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生灌木果樹，其果酸、甘、平，可止痢［1］。現代研究顯示，藍莓果實中含有豐富的花色素花青素、酚酸、有機酸等多種有效成分［2-3］，具有抗腫瘤、增強記憶力、增強視力、調節血脂、延緩衰老、消炎、調節血糖、改善血液循環、減肥等功效［4-12］，因此藍莓被國際糧農組織列為五大健康食品之一［13］。藍莓中的花青素一直是研究的熱點，但有機酸的存在不僅對藍莓的風味有影響，更重要的是對花 色苷等物質具有保護作用。

目前對有機酸的檢測方法很多［14-16］，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術應用于藍莓有機酸的含量檢測也有報道［17-23］，但已有的報道選擇的品種有限，同時測定有機酸的種類也不多。本實驗采用HPLC法同時測定26 種藍莓中8 個有機酸的含量，建立的方法準確可靠，簡便快捷，是一種分析藍莓有機酸類成分的有效途徑，可為藍莓中有機酸的開發利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

藍莓（Vaccinium uliginosum Linn）于2014年6月采自大連大學藍莓研究所試驗基地（大連市亮甲店鎮），品系有北高叢藍莓、半高叢藍莓、矮叢藍莓3 類，其中北高叢藍莓有藍豐（Bluecrop）、藍金（Bluegold）、日出（Sunrise）、雙迪（D-Ⅱ）、伯克利（Berkeley）、赫伯特（Herberd）、迪克西（Dixi）、伊麗莎白（Elizabeth）、塞拉（Sierra）、錢德勒（Chandler）、卡拉（Cara’s Choice）、艾克塔（Echota）、萊格西（Legacy）、藍鳥（Bluejay）、布里吉塔（Brigitta）、藍港（BlueHaven）、克瑞頓（Croaton）、愛國者（Patriot）、維口（Weymouth）、哈里森（Harrison）、柳葉（Willow）21 個品系；半高叢藍莓有北藍（Northblue）、北陸（Northland）、黑珍珠（Black Pearl）3 個品系；矮叢藍莓有艾諾（Aino）、美登（Blomidon）2 個品系，總共26 個品系。

草酸、酒石酸、奎寧酸、甲酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸標準品 百靈威科技有限公司；甲醇（色譜純） 美國Tedia公司；純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司；鹽酸、磷酸、磷酸二氫鉀（分析純） 天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

LC-1260高效液相色譜儀（G4212-60008二極管陣列檢測器） 德國安捷倫科技有限公司；BS224S電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；SB-5200DTD超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；EYELA N-1100旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社上海愛朗儀器有限公司；DLSB-5/20低溫冷卻液循環泵 鄭州長城科工貿有限公司；隔膜真空泵 天津市津騰實驗設備有限公司。

1.3方法

1.3.1標準溶液的制備

分別精密稱取草酸、酒石酸、奎寧酸、甲酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸對照品，用純凈水根據標準品在HPLC中的響應值大小配制成8～20 mg/mL不同質量濃度的標準品儲備液，再稀釋制備成不同質量濃度的對照品溶液。

1.3.2樣品溶液的制備

考察了藍莓果實中有機酸提取時所用溶劑水、甲醇、乙醇及其pH值在1、2和3時對提取效果的影響，同時還考察了料液比的影響，分別以1∶5、1∶10和1∶15各進行3 次實驗。將所得的提取液通過HPLC分析，根據有機酸峰面積的大小，發現有機溶劑提取的峰面積小于水提取，而3個pH值條件下根據峰面積大小提取物量基本一樣；料液比1∶5時峰面積小于料液比1∶10和1∶15，料液比1∶10和1∶15基本無差別。因此最終選擇以水為溶劑并用鹽酸調pH值為1，按1∶10的料液比進行提取時效果最好［24-25］。

最終確定的樣品溶液制備方法為：精密稱取5.0 g藍莓鮮果，切碎，以1∶10料液比加入含0.2%鹽酸的純凈水，超聲提取30 min，過濾，濾渣以上述方法再提取一次，合并濾液，濃縮，定容，待HPLC定量分析。

1.3.3色譜條件

分別考察了流動相為磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨及其濃度分別在0.01、0.02、0.03 mol/L時的分離效果，考慮到檢測成分均為酸性物質，根據樣品中各有機酸化合物的分離度，最后選擇0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液為流動相。此外，在此流動相的分離條件下，流速對各個有機酸的分離度也有重要影響，為了使所測定有機酸化合物達到基線分離，尤其是草酸與其前面未知物、酒石酸與奎寧酸的分離，在1.0 mL/min流速時，這些物質均未達到基線分離，影響定量結果準確性，最終選擇流速為0.8 mL/min。

最終確定的色譜條件為：色譜柱Xtimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀溶液（磷酸調節pH 2.5）；G4212-60008二極管陣列檢測器，檢測波長215 nm；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL［26-28］。

2　結果與分析

2.1有機酸標準曲線的建立

分別吸取不同質量濃度的有機酸對照品10 μL進樣。以有機酸對照品質量濃度X對峰面積Y進行線性回歸，得到標準曲線，按信噪比3∶1確定檢測限，見表1。

表1　8 種有機酸對照品標準曲線方程Table 1 Standard curve equations for eight organic acids

圖1　有機酸標準對照品HPLLCC圖Fig.1 HPLC of standard reference substances of organic acids

2.2HPLC圖譜分析

取草酸、奎寧酸、甲酸等10 種有機酸對照品溶液的混標溶液，進樣10 μL，色譜圖見圖1。從圖1可以看出，10 種對照品有機酸基本達到基線分離，峰形良好。取藍莓樣品藍豐的樣品溶液，進樣10 μL，色譜圖見圖2。從圖2可知，藍莓果實的樣品溶液中含有草酸、奎寧酸、甲酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸8種有機酸，各有機酸成分的分離度較好。

圖2　藍莓果實中有機酸HPLLCC圖Fig.2 HPLC of organic acids in blueberries

2.3精密度實驗結果

取有機酸對照品溶液，按1.3.3節色譜條件連續進樣6 次，計算各有機酸峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果顯示有機酸的RSD在1.17%～2.16%之間，表明所用儀器精密度良好。結果如表2所示。

表2　精密度實驗結果Table 2 Precision for eight organic acids

2.4重復性實驗結果

取品種藍豐的果實，按1.3.2節的樣品溶液制備方法分別提取6 份，按1.3.3節色譜條件分別進樣，計算樣品各有機酸峰面積的RSD，結果其RSD在0.53%～2.73%之間，表明該方法重復性良好。結果如表3所示。

表3　重復性實驗結果Table 3 Repeatability for eight organic acids

2.5穩定性實驗結果

取同一藍莓樣品提取液，按1.3.3節色譜條件，分別在放置0、2、4、8、12 h后進樣分析，記錄峰面積，計算樣品各有機酸峰面積的RSD，結果顯示其RSD在1.22%～3.89%之間，表明供試品溶液在室溫條件下放置12 h穩定性良好，結果如表4所示。

2.6加樣回收率實驗結果

分別取9 份相同質量已知各有機酸含量的藍豐果實樣品按1.3.2節方法制備有機酸提取液，1 份加入純凈水作對照，其余8 份分別加入相同體積不同質量濃度的有機酸對照品溶液，完全混勻后經過0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣10 μL。各有機酸的平均回收率在96.8%～102.8%之間，表明方法準確率高，結果見表5。

表5　加樣回收率實驗結果（n=9）Table 5 Spiked recoveries for eight organic acids （n=9)

2.7藍莓樣品有機酸含量測定結果

按1.3.2節樣品溶液制備方法和1.3.3節色譜條件，分別對不同品種藍莓果實的有機酸含量進行HPLC含量分析，每個品種測定3 次，結果見表6。

2.8不同品種藍莓中有機酸含量

圖3　不同品種藍莓中有機酸含量Fig.3 The contents of organic acids in different species of blueberry

表6　藍莓中有機酸含量Table 6 The contents of various organic acids in blueberry

以各品種中含量最高的兩類有機酸檸檬酸和奎寧酸計算，對比藍莓果實中二者的量，可以反映出不同品種總有機酸的含量。由圖3可知，總含量最高的品種是塞拉，最低的品種是克瑞頓。

3　討論與結論

本研究利用HPLC法建立了同時測定藍莓果實中8 種有機酸的方法，同時分析了大連栽培的26 個不同藍莓品系中有機酸的類型和含量。藍莓果實中主要以檸檬酸為主，占到所有有機酸含量的80%以上，其次為奎寧酸、蘋果酸和草酸。從有機酸在藍莓中的分布來看，北高叢藍莓的21 個品種里，除乙酸在某些品種里未檢測到之外，其他幾個有機酸均含有；所測的半高叢藍莓3 個品系里均含有8 種有機酸成分；而矮叢藍莓中的美登品種也是不含乙酸。不同種類藍莓間，有機酸的含量也有所不同，北高叢藍莓有機酸整體含量要高于半高叢和矮叢藍莓，但北高叢藍莓不同品種間含量差異較大，其中含量最高的品種為塞拉，達25.135 26 mg/g鮮果，最低的品種為克瑞頓，僅含2.368 31 mg/g鮮果；而半高叢和矮叢藍莓中各品種之間差別較小，含量較均一。

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Determination of Eight Organic Acids in Blueberries by HPLC

XU Yutao1， LI Keke1， WANG Hexin2， CHEN Lirong3， GONG Xiaojie1，*
（1. College of Medical， Dalian University， Dalian 116622， China； 2. Modernization of Agricultural Research Center， Dalian University，Dalian 116622， China； 3. College of Environmental and Chemical Engineering， Dalian University， Dalian 116622， China）

A high performance liquid chromatography （HPLC） method was established for the simultaneous determination of 8 organic acids in blueberry fruit extract. This method was then used to determine the contents of organic acids in blueberries from 26 cultivars. Among the blueberry cultivars tested， the content of total organic acids （25.135 26 mg/g fresh fruit） was highest in Sierra and lowest in Croaton （only 2.368 31 mg/g fresh fruit）. This method is simple， reproducible， accurate，reliable and useful for the analysis of organic acids in blueberries.

blueberry； organic acid； citric acid； high performance liquid chromatography （HPLC）； quantifi cation

O656.3；R917

A

1002-6630（2015）18-0127-05

10.7506/spkx1002-6630-201518023

2015-03-23

遼寧省科技廳科學技術計劃項目（2013204001；2014204007）

徐玉濤（1990—），男，碩士研究生，研究方向為中藥質量控制。E-mail：751133491@qq.com

弓曉杰（1963—），男，教授，博士，研究方向為中藥新藥開發。E-mail：gxjclr@163.com