表面等離子共振傳感器檢測(cè)3 種果汁中亞胺硫磷殘留

宋 洋，王 靜，陳曉明*

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津 300384）

表面等離子共振傳感器檢測(cè)3 種果汁中亞胺硫磷殘留

宋 洋1，王 靜1，陳曉明2，*

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；2.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津 300384）

基于亞胺硫磷多克隆抗體，建立蘋果汁、桃汁、橙汁中亞胺硫磷殘留的表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器檢測(cè)方法。采用磷酸鹽緩沖液直接稀釋樣品10倍后，基本消除基質(zhì)影響，加標(biāo)回收率為84.88%～104.69%，變異系數(shù)低于6.70%，樣品的最低檢出限為0.1 μg/L，與高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.992，所建立的SPR檢測(cè)方法達(dá)到了快速準(zhǔn)確檢測(cè)的要求。SPR反應(yīng)芯片對(duì)亞胺硫磷的檢測(cè)時(shí)間為30 min，且在3 d內(nèi)可反復(fù)檢測(cè)30 次，可有效降低檢測(cè)成本。通過(guò)與同源抗體建立的酶聯(lián)免疫方法比較發(fā)現(xiàn)：SPR方法在檢測(cè)限、精確度、靈敏度等方面有著一定優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于單殘留樣品的檢測(cè)，在時(shí)間上不具有明顯優(yōu)勢(shì)，更適合于高通量、多殘留的檢測(cè)。

果汁；亞胺硫磷；表面等離子共振傳感器；酶聯(lián)免疫

果汁飲品在日常生活中被普遍接受，但是在種植過(guò)程中，為了保證水果品質(zhì)及產(chǎn)量，各類農(nóng)藥被廣泛使用，因此果汁也就無(wú)可避免地含有農(nóng)藥殘留。2012年，可口可樂(lè)公司果粒橙被檢出農(nóng)藥超標(biāo)，果汁的農(nóng)藥殘留問(wèn)題受到廣泛關(guān)注。由于不同國(guó)家的經(jīng)濟(jì)和科技發(fā)展水平都存在著較大差距，導(dǎo)致在發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)遭到禁用的高毒性、高殘留農(nóng)藥，在某些發(fā)展中國(guó)家可能仍在使用，造成了各國(guó)在食品安全標(biāo)準(zhǔn)上存在差距［1］。目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有針對(duì)果汁中亞胺硫磷的限量標(biāo)準(zhǔn)，只以相應(yīng)水果的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（maximum residue limit，MRL）作為參考，日本肯定列表對(duì)食品中亞胺硫磷殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：蘋果、桃、橙子、杏的最大殘留限量分別為10、10、10、5 mg/kg。因此，能夠準(zhǔn)確可靠地測(cè)定果汁中農(nóng)藥殘留物的科學(xué)分析就顯得非常重要。亞胺硫磷是中等毒性的有機(jī)磷農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用在水果、蔬菜和糧食作物的生產(chǎn)中［2-3］。美國(guó)環(huán)保總署對(duì)亞胺硫磷在9 種作物上的使用（杏樹(shù)、蘋果、越橘、葡萄、海棠、李子、油桃、梨、桃）做出了限定使用次數(shù)的決定，并增加了在大部分作物上的限制使用時(shí)間間隔，要求附加工人生物監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)和使用限制［4-6］。目前亞胺硫磷主要的檢測(cè)手段是利用大型儀器設(shè)備，如氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）已建立了多種蘋果［7］、西瓜［8］、蔬菜［9］、茶葉［10-11］及糧油［12］的儀器檢測(cè)方法，其方法準(zhǔn)確、靈敏，但儀器方法資本投入大，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，因此不能完全滿足目前食品安全檢測(cè)的需要。21世紀(jì)初，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法作為靈敏、高效、快速的檢測(cè)技術(shù)得到飛速發(fā)展。Liang Ying等［13-14］利用亞胺硫磷硫代磷酸酯半族進(jìn)行結(jié)構(gòu)衍生，制備出硫代磷酸酯有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜多克隆抗體，IC50達(dá)到159.7 ng/mL；Song Yang等［15］利用對(duì)亞胺硫磷結(jié)構(gòu)鄰苯二甲酰亞胺半族結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生，合成人工抗原，成功制備出多克隆抗體，IC50達(dá)到2 0.0 n g/m L，對(duì)蘋果、桃、黃瓜、甘藍(lán)等進(jìn)行了檢測(cè)，達(dá)到了滿意的效果。

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是基于免疫學(xué)原理，兼有儀器方法和免疫學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)［16］。在21世紀(jì)初，已有國(guó)外學(xué)者成功地利用SPR技術(shù)對(duì)環(huán)境水中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行了檢測(cè)［17-19］。Dong Jianwei等［20］利用分子印跡聚合物作為識(shí)別元件偶聯(lián)在SPR芯片表面，對(duì)環(huán)境水中丙溴磷的半定量檢測(cè)。結(jié)果表明，高靈敏的識(shí)別元件可以有效提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。Liu Ming等［21］建立了豬肉中萊克多巴胺高靈敏度SPR間接檢測(cè)方法，并對(duì)全抗原芯片敏感膜的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、反應(yīng)離子體系等進(jìn)行了詳盡的研究。目前，利用SPR技術(shù)檢測(cè)食品中小分子農(nóng)藥的殘留，其間接競(jìng)爭(zhēng)法因穩(wěn)定性及靈敏度較好，在SPR檢測(cè)中使用最為多見(jiàn)，如2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）［22-23］、葉酸［24］等。Song Yang等［25］建立了蔬菜食品中亞胺硫磷的SPR檢測(cè)方法，其檢測(cè)限達(dá)到了ppt級(jí)的痕量檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)基于多克隆抗體研究，在修飾的金片表面結(jié)合了抗原，對(duì)3 種果汁樣品中亞胺硫磷殘留進(jìn)行快速檢測(cè)，經(jīng)HPLC進(jìn)行方法驗(yàn)證。該方法具有不需標(biāo)記、自動(dòng)化程度高、高效等優(yōu)勢(shì)，且偶聯(lián)的芯片可反復(fù)使用多次，大大降低了成本，且偶聯(lián)好的芯片可攜帶至檢測(cè)機(jī)構(gòu)，更加提高了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的效率。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品檢測(cè)的時(shí)間、芯片的穩(wěn)定性及檢測(cè)限等方面與同源抗體建立的ELISA方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)和比對(duì)，為果汁樣品的快速檢測(cè)提供了理論依托和技術(shù)保障。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

100%蘋果汁、100%桃汁、100%橙汁（經(jīng)HPLC檢測(cè)，均不含有亞胺硫磷） 市購(gòu)。

亞胺硫磷（99%）、Tween-20、乙醇胺、碳二亞胺鹽酸鹽（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide h y d r o c h l o r i d e，E D C）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide， 1-hydroxypyrrolidine-2，5-dione，NHS）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）（99%） 美國(guó)Sigma公司；巰基十一酸 百靈威科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司。

1.2儀器與設(shè)備

ESPRIT表面等離子共振生物傳感器、芯片 荷蘭Auto Lab公司；LC-10AT高效液相色譜 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1常用緩沖溶液

0.01mol/LpH7.4的磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate buffered saline，PBS）；10mmol/LpH4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液；PBST緩沖液；100mmol/L NHS溶液；400 mmol/L EDC溶液；1 mmol/L巰基十一酸溶液；1mol/L乙醇胺（pH 8.5）。

1.3.2多克隆抗體

亞胺硫磷多克隆抗體建立在對(duì)其結(jié)構(gòu)的衍生化，得到的半抗原（hapten-PH），經(jīng)過(guò)與鑰孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)得到的免疫原，對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫得到多克隆抗體anti-PH。經(jīng)Protein A-Sepharose 4B純化得到的抗體質(zhì)量濃度為3.50 mg/mL。建立的亞胺硫磷直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法靈敏度為20.00μg/L，檢測(cè)限為0.60μg/L［15］。

1.3.3SPR亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以無(wú)待測(cè)小分子抑制的響應(yīng)值為B0值，一定質(zhì)量濃度的待測(cè)小分子抑制時(shí)的響應(yīng)值為B值，可按式（1）計(jì)算抑制率：

以小分子質(zhì)量濃度的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以B/B0為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程。每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)得3 個(gè)重復(fù)值，對(duì)其響應(yīng)值（y）進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)式（2）。

式中：x為亞胺硫磷的質(zhì)量濃度/（ng/L）；A為空白溶液的響應(yīng)值，即不加亞胺硫磷競(jìng)爭(zhēng)抗原的響應(yīng)值；D為亞胺硫磷質(zhì)量濃度趨于無(wú)窮大時(shí)所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值，可用溶液的背景值代替。

1.3.4樣品前處理

SPR：取1 mL果汁于管中，加入的亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)品后的質(zhì)量濃度水平為0.1、0.2、0.5 μg/L，樣品經(jīng)PBS稀釋10 倍后，過(guò)0.22 μm濾膜，待用。

ELISA：取1 mL果汁于管中，加入的亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)品后的質(zhì)量濃度水平為30、100、200 μg/L，樣品經(jīng)PBS稀釋20 倍，待用。

HPLC：取樣前先將果汁搖勻，在分液漏斗中倒入量取100 mL果汁，并依次加入50 mL乙腈、5 g氯化鈉，用力搖動(dòng)分液漏斗5 min，待氯化鈉溶解完全后，將漏斗靜置10 min；棄去水層后再反復(fù)萃取3 次，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至小體積，后用氮?dú)獯抵帘M干，用1 mL甲醇定容，過(guò)0.22 μm濾膜，供HPLC分析。

1.3.5色譜條件

采用LC-10AT HPLC儀，確定亞胺硫磷的HPLC檢測(cè)條件為：檢測(cè)器：Waters 2998PDA；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm；色譜柱：C18（15 cm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水 （45∶55，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫箱溫度：35 ℃。

1.3.6SPR芯片穩(wěn)定性研究

對(duì)同一芯片與抗體多次反應(yīng)，考察其響應(yīng)值變化，判斷固定化后的芯片使用上限；對(duì)芯片進(jìn)行PBS封閉保存，分別在1、2、3 d對(duì)其與抗體反應(yīng)的響應(yīng)值進(jìn)行比較，通過(guò)變異系數(shù)的考量，判斷其保存時(shí)間。

2　結(jié)果與分析

2.1亞胺硫磷SPR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

圖1　亞胺硫磷SPR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 SPR standard curve of phosmet

在巰基十一酸溶液自組裝芯片上偶聯(lián)20 mg/L PHBSA，將16 mg/L的抗體anti-PH與將不同質(zhì)量濃度的亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積混合，使得亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為（0.0、0.5、2.0、8.0、16.0、32.0、64.0、256.0 n g/L），反應(yīng)緩沖液為1 0 m m o l/L pH 7.4 PBS，工作溫度25 ℃，再生液 0.1 mol/L HCl溶液，抗體反應(yīng)時(shí)間30 min。如圖1所示，建立的SPR亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，其最低檢出限為1.6 ng/L，IC50為10.0 ng/L，線性范圍為8.0～60.0 ng/L（RSN= 3）［25］。

2.2果汁基質(zhì)影響的消除

消除基質(zhì)影響是為了最大化地降低樣品中影響抗原抗體結(jié)合的影響因子的作用，使樣品的基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合。果汁中的糖和色素是基質(zhì)影響的主要因子，通常通過(guò)SPE小柱進(jìn)行凈化后去除。SPR建立在免疫學(xué)基礎(chǔ)上，結(jié)合光學(xué)測(cè)定原理，可對(duì)渾濁或不透明的樣品進(jìn)行測(cè)定，因此可省去復(fù)雜的前處理。由圖2可以看出，果汁通過(guò)PBS緩沖液稀釋10 倍后，其SPR基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合；通過(guò)PBS稀釋20 倍后，其ELISA基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，說(shuō)明基質(zhì)的影響基本消除，可以進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。

圖2　亞胺硫磷樣品的SPR（A）及ELISA（B）基質(zhì)曲線Fig.2 SPR and ELISA standard curves of phosmet in juice samples

2.3SPR方法準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

表1表明，SPR方法回收率為84.88%～104.69%，變異系數(shù)低于6.7 0%；E L I S A方法回收率為79.17%～104.98%，變異系數(shù)低于8.02%。與HPLC方法的線性相關(guān)系數(shù)R2值分別為0.992和0.985，均滿足準(zhǔn)確度要求。

表1　SPR、ELISA添加回收結(jié)果與HPLC相關(guān)系數(shù)（n=4）Table 1 Recoveries of phosmet in spiked juices by SPR and ELISA and linear correlations of the two methods with HPLC （n= 4）

2.4芯片的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

自組裝芯片表面的裸金層和在巰基修飾后是很穩(wěn)定的，一般在極端pH值和中等質(zhì)量濃度的有機(jī)試劑條件下具有較強(qiáng)耐受，可在4 ℃的實(shí)驗(yàn)條件下放置3 個(gè)月，穩(wěn)定性較好。當(dāng)配體被固定于傳感芯片表面上，傳感器芯片對(duì)于各種試劑和條件的耐受程度就主要取決于所連配體的性質(zhì)，如配體濃度、抗酸堿度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等，因此不同反應(yīng)芯片的穩(wěn)定性各不相同。

圖3　芯片的使用次數(shù)與響應(yīng)值關(guān)系Fig.3 Relationship between repeated chip use and response value

考察一個(gè)固定化后的反應(yīng)芯片在與抗體反應(yīng)多次后，響應(yīng)值的變化情況。同一反應(yīng)芯片在1、2、3 d時(shí)，與抗體反應(yīng)的響應(yīng)值分別為68.50、157.62、142.33 m°，結(jié)合圖3可以看出，反應(yīng)芯片與抗體反應(yīng)30 次，響應(yīng)值均比較穩(wěn)定，無(wú)明顯變化，而之后再次反應(yīng)，即出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表示亞胺硫磷反應(yīng)芯片的使用上限為30 次。反應(yīng)芯片在PBS封閉條件下保存3 d，將1、2、3 d的響應(yīng)值比較，得到3 d的響應(yīng)值變異系數(shù)為8.4%，說(shuō)明芯片在液體封閉條件下可保存3 d。為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本，實(shí)驗(yàn)中共反復(fù)使用1、2、3 g 3 個(gè)芯片進(jìn)行測(cè)定，抗體反應(yīng)的響應(yīng)值分別為168.50、154.6、148.7 m°，不同芯片與抗體響應(yīng)值變異系數(shù)為6.46%，表明偶聯(lián)全抗原芯片的穩(wěn)定性較好，該檢測(cè)芯片具有應(yīng)用和推廣意義。

2.5SPR樣品檢測(cè)時(shí)間評(píng)價(jià)

16 μg/mL的抗體anti-PH與芯片上的完全抗原結(jié)合，對(duì)亞胺硫磷進(jìn)行SPR檢測(cè)。將抗原抗體反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定為10、20、30 min進(jìn)行檢測(cè)，其他工作條件保持不變，對(duì)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析，比較各檢測(cè)質(zhì)量濃度的變異系數(shù)。由表2可知，反應(yīng)時(shí)間在30 min時(shí)，各質(zhì)量濃度的變異系數(shù)較低，有穩(wěn)定的響應(yīng)信號(hào)，表明重現(xiàn)性較好，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間不充分時(shí)，各質(zhì)量濃度值具有較大的偏差。因此亞胺硫磷SPR檢測(cè)時(shí)間設(shè)定為30 min。

表2　抗體在芯片表面反應(yīng)不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的相對(duì)響應(yīng)值及標(biāo)準(zhǔn)差（n= 7）Table 2 Relative response values with standard deviations for the antibody on the chip surface at different reaction times （n= 7）

2.6SPR與ELISA對(duì)果汁檢測(cè)方法比較

表3　SPR與ELISA檢測(cè)果汁方法對(duì)比Table 3 Comparison of SPR biosensor and ELISA used for phosmet detection in juices

對(duì)3 種果汁中亞胺硫磷殘留進(jìn)行了SPR樣品檢測(cè)，并在樣品前處理方法、添加回收實(shí)驗(yàn)、與HPLC對(duì)照實(shí)驗(yàn)相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)時(shí)間、抗體質(zhì)量濃度等方面進(jìn)行了系統(tǒng)比較。如表3所示，SPR和ELISA在樣品前處理方面較儀器方法有著明顯優(yōu)勢(shì)，且SPR在靈敏度和準(zhǔn)確度均高于ELISA方法。SPR檢測(cè)時(shí)間為30 min，并且同一固定化芯片可在3 d內(nèi)重復(fù)檢測(cè)30 次，大大節(jié)省了檢測(cè)成本。ELISA方法能2～3 h檢測(cè)幾十個(gè)樣品，由此可見(jiàn)SPR在單殘留的檢測(cè)中，其優(yōu)勢(shì)并不明顯。為了更好地發(fā)揮SPR高質(zhì)量、高通量快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，今后應(yīng)大力發(fā)展SPR在多殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。

3　結(jié) 論

SPR技術(shù)是近些年來(lái)在食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展的新技術(shù)，因其靈敏度高、前處理方法簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、省時(shí)等特點(diǎn)，適合于大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)在多克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立了果汁中亞胺硫磷SPR檢測(cè)方法，樣品最低檢出限為0.1 μg/L，遠(yuǎn)低于國(guó)際限量標(biāo)準(zhǔn)，添加回收率在84.88%～104.69%，與HPLC方法的線性相關(guān)系數(shù)R2為0.992，為果汁中亞胺硫磷農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)提供了新的技術(shù)支持。

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Surface Plasmon Resonance Detection of Phosmet Residues in Three Kinds of Juice

SONG Yang1， WANG Jing1， CHEN Xiaoming2，*
（1. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， College of Life Science， Tianjin Normal University，Tianjin 300387， China； 2. Tianjin Institute of Forestry and Fruit Tree， Tianjin 300384， China）

In the present study， a polyclonal antibody-based method for the quantifi cation of phosmet residues in apple，peach and orange juice was presented using a surface plasmon resonance （SPR） sensor. Samples were directly diluted with PBS to eliminate the matrix effect. Good accuracy and precision were obtained with mean spiked recoveries between 84.88% and 104.69% and coeffi cients of variation less than 6.70%， and the limit of detection （LOD） of juice samples was 0.1 μg/L. The SPR method allowed rapid and accurate detection of phosmet and the correlation coeffi cient （R2） between the data obtained using the method and high-performance liquid chromatography （HPLC） was 0.992. The chip used in the SPR method detected phosmet in 30 min， and could be repeatedly used 30 times within 3 days， reducing the cost of tests. The SPR method was advantageous in the terms of detection limit， accuracy and sensitivity rather other time saving in single-residue analysis compared with the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and was more suitable for highthroughput detection of multi-residues.

juice； phosmet； surface plasmon resonance （SPR） sensor； enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）

R155

A

1002-6630（2015）18-0172-05

10.7506/spkx1002-6630-201518031

2014-12-25

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301487）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD04B03）；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JCQNJC14800）

宋洋（1983—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：skysongy@mail.tjnu.edu.cn

陳曉明（1977—），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與開(kāi)發(fā)。E-mail：chxm001@126.com