金屬硫蛋白基因表達水平評估青海不同地區的重金屬污染程度

薛艷鋒，羅毅皓，劉祥軍，謝鳳蓮，蔣國斌，孫萬成，*

（1.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016；2.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016）

金屬硫蛋白基因表達水平評估青海不同地區的重金屬污染程度

薛艷鋒1，羅毅皓2，劉祥軍2，謝鳳蓮2，蔣國斌2，孫萬成2，*

（1.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016；2.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016）

為揭示青海不同地區重金屬污染的潛在生態風險，從玉樹、果洛、海晏、剛察、共和5個 地區的牦牛肝臟樣品中提取總RNA，在逆轉錄聚合酶的作用下生成cDNA，以逆轉錄產物為模板，利用實時定量PCR檢測牦牛金屬硫蛋白基因的表達水平。若將剛察地區牦牛肝臟金屬硫蛋白cDNA實時熒光定量值作為對照組，2-ΔΔCt值設定為1時，則玉樹、果洛、海晏、共和地區的牦牛肝臟金屬硫蛋白cDNA實時熒光定量值分別為0.669、0.624、0.529、1.320，并且通過酶聯免疫反應測定的牦牛體內金屬硫蛋白的含量，相互印證，從而更加準確地評估青海不同地區牦牛機體重金屬暴露水 平，以便對牦牛產品安全進行評價。基因表達和酶聯免疫反應的實驗結果都表明，共和與剛察地區的重金屬污染可能較為嚴重。

金屬硫蛋白；實時定量聚合酶鏈式反應；基因表達；牦牛；酶聯免疫吸附測定

隨著工業化進程的加快，青海各地區也受到了重金屬不同程度的污染，且重金屬具有親脂性、難降解性和高富集性［1-2］，嚴重威脅著食品安全。金屬硫蛋白（metallothionein，MT），分子質量為6 000～7 000 D，每個MT分子含有61 個氨基酸，可以結合7～12 個金屬離子［3］，是一種分子質量低，疏基含量高，能大量結合重金屬離子的蛋白質。MT分子有2 個獨立的結構域α和結構域β［4-5］，整個分子呈啞鈴狀。MT最早是由Margoshes等從馬的腎臟中發現并且分離出來的［6］，隨后在高等植物、真核微生物、原核微生物當中也發現并且分離得到了MT［7］，證明了MT是普遍存在于各種生物體中［8-9］，李令媛等［10-11］也在大鯢、刺猬中也分離得到了MT。MT的生物學功能：清除自由基，抵抗電離輻射［12-14］，解毒［15］，參與微量元素的代謝［16-18］，調控機體免疫能力和生長發育［19］。MT基因的表達受到多種因素的影響［20］，重金屬是最強的誘導劑［21］，可以將MT表達量提高成百上千倍，因此，MT可以作為生物體內重金屬污染的一個重要的生物學標志［22］，通過檢測生物體內MT的含量變化，來預測生物體受重金屬污染的情況，已經成為了近些年研究的熱點。但多數是測定水生生物體內MT的含量來反應水質污染程度［23-26］，還沒有人通過測定牦牛體內MT含量和MT基因的表達量來評估不同牧場的重金屬污染程度。

青海各個地區的牧場受到了重金屬不同程度地污染，從而使牦牛的肉和乳重金屬含量出現不同程度超標，因此本實驗通過MT基因實時定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）表達差異分析，評估不同地區牦牛體內重金屬的暴露水平。利用PCR技術研究MT基因的相對定量表達水平，即利用實時熒光定量PCR技術定量測定牦牛肝臟中的MT。首先，從不同地區的牦牛肝臟中提取總RNA，然后在逆轉錄聚合酶的作用下生成cDNA，以逆轉錄產物為模板，實施RT-PCR檢測MT基因的表達水平。同時，通過酶聯免疫（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）反應，直接測定青海不同地區牦牛肝臟樣品中的MT含量，與前面通過實時定量測得的MT基因的表達水平對比，再次印證，從而保證得到MT含量的正確性。然后，根據MT含量，正確評估青海不同地區牦牛肉與乳的重金屬暴露水平，以便對牦牛肉乳品質評價、食品安全及環境保護提出指導性的建議。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

分別從青海省的玉樹、果洛、海晏、剛察、共和這5 個地區，采集現殺的不同牦牛的肝臟組織（采集樣品所用的手術刀、鑷子等嚴格滅菌），迅速裝于冷凍管中，保存在液氮罐中，帶回實驗室后，將樣品從液氮罐中取出，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

氯仿、異丙醇、乙醇 上海友盛化工科技有限公司；RNase-free water、RNAiso Plus、反轉錄試劑盒、熒光定量染料 日本TaKaRa公司；MT ELISA試劑盒、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸鈉、聚丁二酸丁二醇酯緩沖液（pH 7.4） 上海江萊生物科技有限公司。

利用GenBank中介紹的牦牛（Bos grunniens）MT基因GenBank Accession No：AY513744，通過核心序列設計5'和3'端特異性引物利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1），引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1　牦牛MT基因cDNA克隆引物Table 1 cDNA cloning primers of yak metallothionein gene

1.2儀器與設備

PCR擴增儀、RT-PCR儀、核酸電泳儀 美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機 美國Sigma公司；凝膠成像系統 英國Syngene公司；移液槍 上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取

將超低溫凍結的RNA提取樣品（牦牛肝臟樣品）迅速轉移至用液氮預冷過的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮冷卻，直至將樣品研磨成粉末狀；向研缽中加入1.5 mL的RNAiso Plus勻漿，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋；室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續研磨至裂解液呈透明狀；使用移液槍將勻漿液轉移至離心管中，室溫靜置5 min；在12 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min；小心吸取上清液，使用移液槍轉移到新的離心管中（切勿觸及、吸取沉淀）；向上述勻漿裂解液中加入氯仿300 μL（RNAiso Plus的1/5體積量），用手劇烈振蕩15 s，待溶液充分乳化后，再室溫靜置5 min；在12 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min；吸取上清液轉移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）；向上清液中加入等體積提前預冷過的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15～30 ℃條件下靜置10 min；12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min；棄去上清液，緩慢地沿離心管壁加入提前預冷的體積分數75%乙醇溶液l mL（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒，洗滌離心管管壁；在12 000 r/min，4 ℃條件下離心5 min；使用移液槍小心棄去乙醇，切勿觸及沉淀，剩下的少量乙醇，讓其自然揮發除去。室溫干燥沉淀2～5 min，加入適量的RNA-free water溶解沉淀后，-80 ℃條件下保存。

1.3.2cDNA的合成

將提取到的牦牛肝臟樣品的總RNA進行反轉錄，主要參考TaKaRa反轉錄試劑盒進行，采用10 μL反轉錄體系，進行PCR擴增得到cDNA。反轉錄反應條件如下：37 ℃，15 min（反轉錄反應）；85 ℃，5 s（反轉錄酶的失活反應）。

1.3.3RT-PCR反應

以合成的牦牛肝臟樣品的cDNA為模板，按TaKaRa試劑盒推薦方法在冰盒上進行操作。加入引物MT1F1-MT1R1進行RT-PCR，同時選擇內參β-actinF1-β-actinR1進行RT-PCR作為對照。兩步法PCR擴增標準程序：循環 1：預變性，95 ℃，30 s；循環40：PCR反應，95 ℃，5 s，60 ℃，30 s。

1.3.4ELISA反應

按照ELISA試劑盒，采用雙抗體夾心法測定樣品中MT水平。用純化的MT抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入MT，再與HRP標記的MT抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化條件下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MT呈正相關。用酶標儀在波長450 nm處測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中MT含量。

2　結果與分析

2.1提取的RNA檢測

圖1　不同地區牦牛肝臟樣品RNA電泳圖Fig.1 RNA electrophoretogram of yak liver samples from different regions

提取出的不同地區牦牛肝臟樣品的總RNA在質量分數1.2%瓊脂糖凝膠上的電泳結果。由圖1可以清楚地看到28S、18S、5S三條亮帶，且28S條帶亮度大概是18S條帶亮度的2 倍。

2.2牦牛肝臟MT基因cDNA的合成

圖2　cDNA經PCR擴增成DNA的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of DNA fragment amplifi ed from cDNA by PCR

圖2由提取的總RNA反轉錄后合成cDNA，再通過普通PCR擴增成DNA得到的電泳圖。利用在編碼區兩側設計的牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ通用引物擴增目的DNA，獲得約190 bp的DNA片段［27］，本實驗應用DL5 000的Marker可以看出在100～250 bp之間。

2.3MT基因PCR熒光定量

表2　不同地區牦牛MT基因熒光定量PCRTable 2 Fluorescence quantitative PCR of metallothionein gene of yaks from different regions

表3　不同地區牦牛MT基因的Ct值對比（x±s）Table 3 Comparison of the Ct values of metallothiof yaks from different regions（x±s）

表3　不同地區牦牛MT基因的Ct值對比（x±s）Table 3 Comparison of the Ct values of metallothiof yaks from different regions（x±s）

地區玉樹果洛海晏剛察共和引物MT反應Ct18.87±4.1321.80±4.9821.45±6.4715.63±0.3115.05±0.41內參β-actin反應Ct22.74±3.1925.58±4.0424.98±3.3420.10±0.3819.91±0.36

通過比較閾值法（2-ΔΔCt）進行相對定量［22］。循環次數（cycle times，Ct）為樣品中PCR擴增反應的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。以剛察地區的牦牛肝臟樣品作為對照樣，并將其2-ΔΔCt值設為1進行閾值比較，如表2、3所示。

計算得出：玉樹：2-（-3.88+4.46）=0.669；果洛：2-（-3.78+4.46）=0.624；海晏：2-（-3.54+4.46）=0.529；共和：2-（-4.86+4.46）=1.320。

由上述公式計算得到的結果可以看到MT相對定量的拷貝數（圖3）。

本實驗以青海省的玉樹、果洛、海晏、剛察、共和這5 個地區的牦牛肝臟為樣品，通過對MT的DNA重復3 次進行熒光定量PCR檢測法，測出它們的平均ΔCt值，再根據比較閾值法進行相對定量得到最后的結果。

由圖3可以看出，共和地區的牦牛樣肝臟品中的MT相對定量的拷貝數最高，接下來依次是剛察、玉樹、果洛、海晏。由此可以得到，青海不同地區牦牛肝臟樣品中的MT含量從高到低依次為共和、剛察、玉樹、果洛、海晏。

圖3　MT相對定量拷貝數Fig.3 Relative quantitative copy number of metallothionein gene

根據測定的各個地區的Ct值，利用SPSS 16.0分析軟件計算得出5 個地區MT含量的差異顯著性如表4所示。

表4　不同地區牦牛MT含量差異顯著性分析Table 4 Signifi cance analysis on the difference in metallothionein contents of yak livers from different regions

表5　ELISA反應測定的不同地區牦牛MT含量Table 5 Metallothionein contents of yak livers from different regions determined by ELISA

圖4　ELISA反應測定的不同地區牦牛MT含量Fig.4 Metallothionein contents of yak livers from different regions determined by ELISA

由表5和圖4可知，ELISA反應所測定MT的含量從高到低依次是：共和、剛察、果洛、海晏、玉樹，但是5個地區的含量差異都不顯著（P＞0.05）。

ELISA反應測得的不同地區的牦牛樣品中MT的含量（圖4），也可以明顯看出，共和地區的牦牛樣品中MT含量比對照組高，而玉樹、果洛、海晏3 個地區牦牛MT的含量比對照組低，這也正好印證了通過相對定量法測定的不同地區牦牛體內MT含量的差異對比。基因表達和ELISA反應2 種方法的測定結果基本相符，提高了所測定MT含量結果的正確性和可信度。由于MT可以作為潛在的新型生物標志物，用來評價重金屬對環境生態系統的生物效應，可以判斷出共和地區牦牛重金屬污染嚴重。而造成污染的原因可能有：工業化進程加快及礦產資源的開發利用；礦產企業多為小企業，缺乏必要的技術管理及生產設備，出現隨意排放污水及礦業廢渣的情況；青海的畜產品安全風險監測評估與預警工作基礎薄弱，對有害因素的風險監測與評估尚處起步階段。

3　結 論

根據MT基因的表達水平可知，玉樹、果洛、海晏、剛察、共和5 個地區的樣品ΔCt的平均值分別為-3.88、-3.78、-3.54、-4.46、-4.86。利用2-ΔΔCt進行比較，將剛察樣品的2-ΔΔCt設定為1，再通過計算得到玉樹、果洛、海晏、剛察、共和5 個地區樣品的2-ΔΔCt分別為0.669、0.624、0.529、1.000、1.320。根據ELISA反應的測定結果可知，玉樹、果洛、海晏、剛察、共和5 個地區的樣品MT含量分別為732.82、746.97、739.61、776.96、778.66 ng/L。

共和地區牦牛MT基因表達量比對照組高，表明共和地區牦牛肝臟含有的MT比對照組多。玉樹、果洛、海晏3 個地區牦牛MT表達量比對照組低，表明玉樹、果洛、海晏3 個地區牦牛肝臟含有的MT比對照組低。并且，ELISA反應測定的結果也是共和MT含量高于對照組，而玉樹、果洛、海晏MT含量低于對照組。因此，可以判定青海省共和、剛察2個牧場的重金屬污染程度較重，而玉樹、果洛、海晏的重金屬污染程度較輕。對于重金屬污染程度較重的共和、剛察地區必須嚴格規范礦產資源的開發和利用，嚴防工業污水和礦產廢渣的隨意排放，另外，必須加強這2 個地區畜產品的安全評估，確保食品質量安全。

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Assessment of Heavy Metal Pollution by Expression of Yak Metallothionein Gene in Qinghai

XUE Yanfeng1， LUO Yihao2， LIU Xiangjun2， XIE Fenglian2， JIANG Guobin2， SUN Wancheng2，*
（1. Academy of Animal Science and Veterinary Medicine， Qinghai University， Xining 810016， China；2. College of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining 810016， China）

In order to study the potential risk of heavy metal contamination in Qinghai， total RNA was extracted from yak liver samples from fi ve regions， Yushu， Guoluo， Haiyan， Gangcha and Gonghe， and then cDNA was generated under the action of reverse transcription polymerase. The product of reverse transcription reaction was fi nally used to carry out RTPCR and detect the expression levels of metallothionein （MT） gene. The results showed that when yak liver sample from Gangcha was taken as the control group and the value of 2-ΔΔCtwas set to be 1， the fl uorescence quantitative values of yak livers from Yushu， Guoluo， Haiyan and Gonghe were 0.669， 0.624， 0.529 and 1.320， respectively. Meanwhile， these results were confi rmed by comparison with those of ELISA reaction. The exposure levels of heavy metal in yak body from different regions in Qinghai were evaluated， so that we could come up with assessment to yak production safety. Both the results of gene expression （mRNA level） and ELISA reaction （protein level） displayed that the most serious pollution regions of heavy metal were Gonghe and Gangcha.

metallothionein； real-time polymerase chain reaction； gene expression； yak； enzyme-linked immuno sorbent assay

TS201.2

A

1002-6630（2015）18-0177-05

10.7506/spkx1002-6630-201518032

2015-01-16

國家自然科學基金重點項目（31160125）

薛艷鋒（1990—），男，碩士研究生，研究方向為動物營養與飼料科學。E-mail：945982845@qq.com

孫萬成（1972—），男，教授，博士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：sun.wancheng0108@aliyun.com