固相萃取凈化-高效液相色譜法測(cè)定食品中α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚殘留量

彭 芳，雷美康，許菲菲，柴明青，祝子銅，徐倩倩，李 東，余 琪

（1.衢州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 衢州 324002；2.義烏出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 義烏 322000）

固相萃取凈化-高效液相色譜法測(cè)定食品中α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚殘留量

彭 芳1，雷美康1，許菲菲2，柴明青2，祝子銅1，徐倩倩1，李 東1，余 琪1

（1.衢州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 衢州 324002；2.義烏出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 義烏 322000）

建立用于測(cè)定乳粉、綠豆糕、豬肉、熏魚(yú)肉、調(diào)味粉中白菖蒲油主要成分α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚含量的固相萃取-高效液相色譜分 析方法。選擇乙腈提取樣品中的細(xì)辛醚，提取液經(jīng)硅膠固相萃取小柱凈化，采用配備熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行分離測(cè)定，外標(biāo) 法定量。乳粉、綠豆糕、豬肉、熏魚(yú)肉、調(diào)味粉中α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的方法定量限均為0.01 m g/kg，在0.01～0.50 mg/kg的添加水平范圍內(nèi)，α-細(xì)辛醚的 平均回收率在78.2%～99.4%之間，β-細(xì)辛醚的平均回收率在80.8%～10 5.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～10.3%。該方法能夠滿足食品中細(xì)辛醚的痕量檢測(cè)要求。

α-細(xì)辛醚；β-細(xì)辛醚；食品；固相萃取；高效液相色譜法

菖蒲作為藥材在印度和埃及至少已有2 500 a的歷史。我國(guó)《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，使用也有2 000 a的歷史。菖蒲作為一種補(bǔ)藥和興奮劑聞名已久，在歐洲和美國(guó)也廣泛使用。它能增進(jìn)食欲，改善消化功能而用于食物的烹調(diào)。其味苦、辛，有特殊的芳香氣味，可用于肉類(lèi)、禽類(lèi)的鹵制、醬制加工品。既有開(kāi)胃、減輕腸氣、緩解消化不良的作用，又有去腥去臭和增香增味的作用［1］。白菖蒲油是國(guó)際市場(chǎng)上重要的精品油之一，由天南星科植物白菖蒲的根莖經(jīng)水蒸氣蒸餾制得，為淡黃至淡褐色黏稠狀揮發(fā)性精油，呈奶油似香氣，略帶苦辣味。歐洲、美洲的白菖蒲油在食品中，同小豆蔻油、獨(dú)活油、生姜油等用于各種烹飪中。在含酒精飲料中可令飲料溫暖辛香［1］。白菖蒲油的主要活性成分為α-細(xì)辛醚（又稱(chēng)α-細(xì)辛腦）和β-細(xì)辛醚（又稱(chēng)β-細(xì)辛腦）。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局在1971年宣稱(chēng)白菖蒲油中的細(xì)辛醚具有致癌性，歐美等國(guó)家也因?yàn)榘纵牌延涂赡軙?huì)對(duì)人體帶來(lái)潛在的健康危害，對(duì)細(xì)辛醚的人體攝入量作出了嚴(yán)格限定。由消費(fèi)者健康保護(hù)協(xié)會(huì)歐洲委員會(huì)食品科學(xué)委員會(huì)發(fā)布，2001年12月12日實(shí)施的《食品科學(xué)委員會(huì)對(duì)調(diào)味劑和其它食品配料中含β-細(xì)辛醚的評(píng)價(jià)》中明確提出β-細(xì)辛醚人最大日可攝取量為115 μg［2］。

目前α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的檢測(cè)方法主要集中在氣相色譜法［3-4］、高效液相色譜法［5-18］和氣相色譜-質(zhì)譜法［19-20］，近年也發(fā)展起來(lái)液相色譜-質(zhì)譜法［21-23］，但僅限于 測(cè)定藥材、血漿及煙草中其含量，針對(duì)食品中細(xì)辛醚含量的檢測(cè)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取-高效液相色譜法研究了5 種食品中α-細(xì)辛醚 和β-細(xì)辛醚殘留的定性和定量分析方法，用乙腈提取樣品中的細(xì)辛醚，離心，上清液減壓蒸干后，正己烷溶解殘?jiān)枘z固相萃取小柱凈化，采用配備熒光檢測(cè)器的高效液相色譜進(jìn)行分離測(cè)定，外標(biāo)法定量。方法的靈敏度和準(zhǔn)確性能夠滿足日常對(duì)食品中白菖蒲油有效成分α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚含量測(cè)定的需求。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豬肉、熏魚(yú)肉、綠豆糕、調(diào)料粉、乳粉來(lái)源于當(dāng)?shù)爻小?/p>

乙酸乙酯、乙腈、正己烷、甲醇（均為色譜純）德國(guó)Meker公司；α-細(xì)辛醚（純度≥98%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；β-細(xì)辛醚（純度≥70%） 德國(guó)DR公司。

1.2儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器、Silica硅膠固相萃取小柱（1 g，6 mL，使用前依次用5 mL乙酸乙酯、5 mL正己烷活化，保持柱體濕潤(rùn)）） 美國(guó) Agilent公司；ROTAVAPOR R-210真 空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（配1 00 mL雞心瓶） 瑞士Büchi公司；Biofuge Primor離心機(jī)（不低于4 000 r/min） 美國(guó)Thermo公司。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，該溶液配制于棕色容量瓶中，-18 ℃以下避光保存；標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋至1.0 μg/mL。該溶液配制于棕色容量瓶 中，-18 ℃以下避光保存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：根據(jù)需要，臨用時(shí)吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用甲醇配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在0～4 ℃避光冷藏保存；水為超純水。

1.3.2提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g試樣（精確到0.01 g）置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，以4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，再用20 mL乙腈重復(fù)上述提取步驟，合并提取液。在45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加入3 mL正己烷，渦旋振蕩溶解，待凈化。

1.3.3凈化

將待凈 化溶液轉(zhuǎn)移至 固相萃取柱中，用3 mL正己烷沖洗雞心瓶，洗液上柱淋洗，棄去淋洗液，用8 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液至上述雞心瓶中，在 45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用2 mL甲醇溶解殘?jiān)芙庖哼^(guò)0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.4色 譜分析條件

Ag ilent XCB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；激發(fā)波長(zhǎng)：265 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：365 nm；柱溫30 ℃；流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的選擇

α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚可溶于甲醇、乙腈和乙酸乙酯。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇、乙腈和乙酸乙酯提取，結(jié)果表明三者均有滿意的回收率，但經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯、甲醇提取的雜質(zhì)較乙腈多，特別是油狀物的雜質(zhì)，為下一步凈化帶來(lái)困難，因此本實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為提取溶劑。

2.2凈化方法的選擇

固相萃取凈化方法是復(fù)雜基質(zhì)中痕量檢測(cè)常用的凈化方法。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的極性大小等理化性質(zhì)，研究了C18、HLB、弗羅里硅土和硅膠4 種固相萃取方法的凈化效果，在上樣溶劑的選擇上，分別比較乙腈、甲醇、甲醇-水混合體系、乙酸乙酯和正己烷；在洗脫溶劑的選擇上，分別比較了乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙酸乙酯-正己烷混合體系的回收率和凈化效果。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，選擇硅膠固相萃取小柱凈化，正己烷作為上樣液，乙酸乙酯作為洗脫液的固相萃取凈化方法，去除雜質(zhì)干擾效果好，簡(jiǎn)便快捷，具有良好的色譜保留，回收率穩(wěn)定。

2.3色譜條件的優(yōu)化

對(duì)α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，固定激發(fā)波長(zhǎng)257 nm，對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，得到最大發(fā)射波長(zhǎng)為365 nm；固定發(fā)射波長(zhǎng)為365 nm，對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描得到最大激發(fā)波長(zhǎng)為265 nm。因此確定激發(fā)波長(zhǎng)為265 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為365 nm。實(shí)驗(yàn)采用Agilent XCB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，甲醇-水，乙腈-水作為流動(dòng)相比對(duì)分離效果，結(jié)果表明，2 種色譜柱和2 種流動(dòng)相都能得到滿意的效果。考慮到成本，本實(shí)驗(yàn)選擇Agilent XCB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，甲醇-水（60∶40，V/V）作為流動(dòng)相，30 ℃作為參考色譜條件。在上述色譜條件下，α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的保留時(shí)間分別約為14 min和12 min，見(jiàn)圖1。

圖 11 α--細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of α-asarone and β-asarone standards

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系及方法定量限

用甲醇配成α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0 mg/L和2.5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。儀器響應(yīng)峰面積Y對(duì)應(yīng)細(xì)辛醚質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸，2 種細(xì)辛醚的線性關(guān)系良好，見(jiàn)表1。以實(shí)際檢測(cè)時(shí)的信噪比（RSN＞10）確定方法定量限，豬肉、熏魚(yú)肉、綠豆糕、調(diào)料粉、乳粉中的α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚含量的方法定量限均為0.01 mg/kg。

表1　-細(xì)辛醚和-細(xì)辛醚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 1 Regression equations with correlation coeffifi cients and linear ranges for -asarone and -asarone

2.5實(shí)驗(yàn)室內(nèi)回收率和精密度

表2　空白樣品添加細(xì)辛醚的回收率及精密度（n=6）Table 2 Recoveries and precision of asarones in blank samples （n= 6）

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白樣品中添加3 個(gè)水平的細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在0.01～0.50 mg/kg的添加水平范圍內(nèi)，α-細(xì)辛醚的平均回收率在78.2%～99.4%之間，β-細(xì)辛醚的平均回收率在80.8%～105.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～10.3%，滿足日常檢測(cè)需要。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了用于檢測(cè)乳粉、綠豆糕、豬肉、熏魚(yú)肉、調(diào)味粉等食品中白菖蒲油主要成分α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚含量的固相萃取-高效液相色譜分析方法。選擇乙腈提取樣品中的細(xì)辛醚，提取液經(jīng)硅膠固相萃取小柱凈化，采用配備熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行分離測(cè)定，外標(biāo)法定量。該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可用于乳粉、綠豆糕、豬肉、熏魚(yú)肉、調(diào)味粉等中的α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚殘留的定性和定量分析。

［1］ 張衛(wèi)明， 肖正春. 中國(guó)辛香料植物資源開(kāi)發(fā)與利用［M］. 南京： 東南大學(xué)出版社， 2007： 117-118.

［2］ 石琛， 方永奇. 細(xì)辛醚的研究進(jìn)展［J］. 中醫(yī)藥學(xué)刊， 2006， 24（7）：1285-1286.

［3］ 魏立平， 昊玫涵. 用氣相色譜法同時(shí)測(cè)定石菖蒲揮發(fā)油中α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的含量［J］. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 21（1）： 62-64.

［4］ 賀凌云， 吳建平， 劉文芳. 毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定細(xì)辛腦及有關(guān)物質(zhì)［J］. 分析試驗(yàn)室， 2007， 26（10）： 84-87.

［5］ 柯雪紅， 魏剛， 方永奇. HPLC測(cè)定石菖蒲藥材中β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的含量［J］. 中成藥， 2002， 24（10）： 791-792.

［6］ 柯雪紅， 方永奇. RP-HPLC測(cè)定石菖蒲、水菖蒲藥材中β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的含量［J］. 中國(guó)中藥雜志， 2004， 29（3）： 279-280.

［7］ WIDMER V， SCHIBLI A， REICH E. Quantitative determination of beta-asarone in calamus by high-performance thin-layer chromatography［J］. Journal of A OAC International， 2005， 88（5）：1562-1567.

［8］ 吳建平， 賀凌云. 反相高效液相色譜法測(cè)定α-細(xì)辛腦的含量及有關(guān)物質(zhì)［J］. 藥物分析雜志， 2007， 27（3）： 364-366.

［9］ 李少剛， 郭歡， 郭小青. HPLC法檢測(cè)細(xì)辛腦注射液的有關(guān)物質(zhì)［J］.臨床藥學(xué)， 2008， 17（10）： 850-851.

［10］ 崔凌云， 于翠霞， 余潛， 等. 高效液相熒光色譜法測(cè)定人血漿中細(xì)辛腦的濃度［J］. 中國(guó)藥師， 2008， 11（6）： 669-672.

［11］ 鄭厚林， 陳陽(yáng)建. HPLC法測(cè)定寧心益智膠囊中β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚的含量［J］. 中國(guó)藥師， 2011， 14（10）： 1473-1474.

［12］ 王瑩， 侯林， 陳智， 等. 高效液相色譜法測(cè)定石菖蒲揮發(fā)油中β-細(xì)辛醚的含量［J］. 食品與藥品， 2011， 13（7）： 274-276.

［13］ 劉柳芳， 魏剛， 張瓊丹， 等. 含石菖蒲復(fù)方煎劑中β-細(xì)辛醚的含量測(cè)定研究［J］. 中藥新藥與臨床藥理， 2012， 23（2）： 194-197.

［14］ 柯雪紅， 方永奇. HPLC法測(cè)定神昌丸中β-細(xì)辛醚的含量［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2004， 10（4）： 15-17.

［15］ 劉眷海， 劉西京， 楊華生. 石菖蒲揮發(fā)油的GC-MS分析［J］. 中醫(yī)藥學(xué)刊， 2006， 24（7）： 1280-1281.

［16］ 嚴(yán)全鴻， 饒春意. 高效液相色譜法測(cè)定參杞益腦膠囊中β-細(xì)辛醚的含量［J］. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2008， 19（9）： 2222-2223.

［17］ 張會(huì)宗， 劉晶， 邸子真， 等. 高效液相色譜法測(cè)定細(xì)辛屬藥材中α-細(xì)辛醚含量［J］. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2009， 28（9）： 1349-1351.

［18］ 王曉麗， 徐天嬌， 孫輯凱， 等. 高效液相法測(cè)石菖蒲環(huán)糊精包合片中β-細(xì)辛醚的含量［J］. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2014， 35（6）： 858-859.

［19］ 陳澤彬， 陳日來(lái)， 陳連劍， 等. 小兒遺尿分散片中α-細(xì)辛醚的含量測(cè)定［J］. 中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用， 2010， 4（11）： 1-2.

［20］ 吳達(dá)， 張怡春. YC/T 361—2010 煙用添加劑β-細(xì)辛醚的測(cè)定： 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［S］. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

［21］ 陳偉， 劉玉玲， 賀玖明， 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定兔血漿中α-細(xì)辛腦的濃度［J］. 藥物分析雜志， 2006， 26（10）： 1364-1368 .

［22］ NANDAKUMAR S， MENON S， SHAILAJAN S. A rapid HPLCESI-MS/MS method for determination of β-asarone， a potential antiepileptic agent， in plasma after oral administration of Acorus calamus extract to rats［J］. Journal of Biomedical Chromatography， 2012， 27（3）：318-326.

［23］ 劉莉， 周世玉. 超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)癲癇平片中β-細(xì)辛醚含量［J］. 中國(guó)藥業(yè)， 2012， 21（20）： 44-45.

Determination of α-asarone and β-asarone Residues in Foods by Solid Phases Extraction-Liquid Chromatography

PENG Fang1， LEI Meikang1， XU Feifei2， CHAI Mingqing2， ZHU Zitong1， XU Qianqian1， LI Dong1， YU Qi1
（1. Quzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ， Quzhou 324002， China；2. Yiwu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Yiwu 322000， China）

A sens itive and selective method was developed for the determination of residues of α-asarone a nd β-asarone as the main components of calamus oil in milk powder， mung bean cake， pork， smoked fi sh， and seasoning powder. The residues of α-asarone and β-asarone in the test samples were extracted with acetonitrile. The extract was cleaned up with a silica gel solid phase extraction column， analyzed by high performance liquid chromat ography （HPLC） equipped with a fl uorescence detector， and quantifi ed by external standard method. Milk powder， green bean cake， pork， smoked fi sh and seasoning powder were chosen as the representative samples. The limit of quantifi cation （LOQ） （RSN＞ 10） was 0.01 mg/kg in al l these sample s. The average recoveries of α-asarone and β-asarone at three spiked levels （0.01， 0.05 and 0.50 mg/kg）ranged from 78.2% to 99.4% and 80.8% to 105.6%， respectively， with rela tive st andard deviations （RSDs） between 1.6% and 10.3%. The method can meet the analytical requirements for trac e asarones in foods.

α-asarone； β-asarone； food； solid phase extraction （SPE）； high performance liquid chromatography （HPLC）

O657.63

A

1002-6630（2015）18-0190-03

10.7506/spkx1002-6630-201518035

2014-10-22

國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目（2009B527）

彭芳（1982—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。E-mail：vivian_pf@126.com