高效液相色譜法測定水產品中甲基睪酮殘留量的不確定度評定

張惠峰，綦天華

（長春市水產品質量安全檢測中心，吉林 長春 130033）

高效液相色譜法測定水產品中甲基睪酮殘留量的不確定度評定

張惠峰1，綦天華2

（長春市水產品質量安全檢測中心，吉林 長春 130033）

依據JJF1059—2012 《測量不確定度評定與表示》和CNAS-GL-06《化學分析中不確定度的評估指南》，建立了高效液相色譜法測定水產品中甲基睪酮殘留的不確定度評定的數學模型。對測量過程中各不確定度來源進行分析，計算各不確定度分量，最后給出合成標準不確定度和擴展不確定度，評定結果表明：不確定度主要來源于測試過程的隨機效應、曲線校準和樣品處理過程。

不確定度；甲基睪酮；高效液相色譜法；水產品

甲基睪酮又名甲睪酮、甲基睪丸酮、甲基睪丸素。是一種合成類固醇，屬于蛋白同化激素，具有雄性和蛋白同化雙重作用［1-2］。曾作為一種性激素和強壯劑被廣泛用于水產養殖業中，如羅非魚、鯉魚、鰻魚、鱔魚、鱒魚、甲魚等。甲基睪酮代謝時間長，對人類的危害是慢性、遠期和積累性的，主要干擾體內自然激素的平衡，使生理功能紊亂，并且可干擾肝內毛細膽管的排泄功能［3］。目前，高效液相色譜法已廣泛用于水產品中甲基睪酮的定量檢測，我國已規定在水產品中甲基睪酮為不得檢出，因此對甲基睪酮殘留量的監測已成為一項重要的常規檢測項目［4］。

測量不確定度對于測量結果之間的比較、數據解釋、檢測程序中需要注意的因素、方法的確認等都有著十分重要的意義，因此在水產品安全檢測等各領域越來越受到重視。學者曾研究了水產品中孔雀石綠［5-6］、多氯聯苯［7］、硝基呋喃類代謝物［8］、揮發性鹽基氮［9］、磺胺類藥物［10］、喹諾酮類藥物［11］等殘留量檢測方法［12-17］的不確定度評定，目前國內尚無甲基睪酮殘留量測定不確定度評定的相關報道。本實驗依據不確定度的評定的基本方法和程序［18-22］，以高效液相色譜法［23］為例，探討水產品中甲基睪酮殘留測定的不確定度的來源、分析評定、合成及結果表述。建立該方法的測量不確定度模型，分析影響測定結果的各主要分量，在實際操作中可用于指導分析人員進行重點控制，從而提高測定結果的準確性和可靠性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

水產品（鱈魚、鯉魚、鳙魚） 長春東北亞物流有限公司；甲基睪酮標準品（純度99%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

1200高效液相色譜儀（配紫外檢測器和自動進樣器） 美國Agilent公司；XS205分析天平 瑞士Mettler公司；TE212-L電子天平 德國Sartorius公司；TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；R-215旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；Research plus可調量程移液器 德國Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1標準溶液的配制

標準儲備液：精密稱取甲基睪酮標準品0.010 0 g，用甲醇溶解，定容于500 mL容量瓶中，質量濃度為20 μg/mL。

標準中間液：準確量取上述標準儲備液5 mL用甲醇稀釋并定容至10 mL容量瓶，質量濃度為10 μg/mL。

標準工作液：用甲醇將標準中間液逐級稀釋成質量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、10.00、5.001.00、 μg/mL的標準工作液，供高效液相色譜分析。

1.3.2樣品提取和凈化

樣品處理采用SC/T 3029—2006《水產品中甲基睪酮殘留量的測定：液相色譜法》［23］進行，方法檢出限10 μg/kg。，具體步驟如下：精確稱取5.00 g經充分勻漿的魚肉于50 mL玻璃離心管中，加入20 mL乙醚，旋渦混勻15 min，4 000 r/min離心10 min，所得上清液移至雞心瓶；殘渣加入15 mL乙醚再提取一次，合并上清液至雞心瓶，在40 ℃左右水浴中減壓旋轉蒸發至干，殘渣中加入5 mL甲醇溶液（4∶1）清洗，轉移至10 mL具塞玻璃離心管中。加入4 mL石油醚至離心管中，加塞旋渦混勻2 min，4 000 r/min離心10 min，棄去上層石油醚層；下層加入4 mL石油醚重復操作一次。下層甲醇溶液在40 ℃左右水浴中減壓旋轉蒸發至0.5 mL，轉移至10 mL具塞離心管。加入2 mL水清洗瓶壁，合并水溶液，加入4 mL乙醚，旋渦混勻2 min，4 000 r/min離心10 min，取上層乙醚層于雞心瓶中；下層用4 mL乙醚再提取一次，合并上層至雞心瓶中。在40 ℃左右水浴中減壓旋轉蒸發至干，1 mL流動相定容，經聚四氟乙烯膜過濾，待測。

1.3.3色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（72∶28 ，V/V）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2　結果與分析

2.1建立數學模型

式中：w為水產樣品中藥物殘留量/（μg/kg）；Cx為提取樣液中藥物質量濃度/（μg/mL）；Vx為提取樣液定容體積/mL；m為樣品質量/g；為回收率校正因子。

2.2不確定度的來源分析

2.2.1曲線校準過程引入的不確定度

包括標準工作曲線擬合所引入的不確定度、標準溶液稀釋過程所引入的不確定度。其中標準溶液稀釋過程中的不確定度由標準品的不確定度、移液管和容量瓶體積的不確定度、校準和使用溫度不同導致的不確定度組成。

2.2.2樣品質量引入的不確定度

由天平的最大允許誤差構成。

2.2.3樣品加標過程引入的不確定度

由目標樣品在制備過程中由于加標的體積的不確定度構成，非加標樣品可不考慮該部分。

2.2.4樣品前處理過程引入的不確定度

測試樣品的制備過程非常復雜，每一步操作均會引入不確定度，采用檢測方法確認中的回收率對制樣過程中引入的不確定度進行評定。

2.2.5體積引入的不確定度

由定容體積和進樣體積的不確定度構成。

2.2.6儀器引入的不確定度

由液相色譜儀引入的不確定度。

2.2.7測試過程隨機效應導致的不確定度

包括樣品的均勻性和代表性、天平的重復性、體積刻度充滿的重復性、進樣的重復性、和儀器積分面積重復性等因素引起的不確定度。

2.3不確定度的分量評定

根據不確定度的來源分別對校準過程、樣品質量、樣品加標、樣品處理、液相色譜測試及隨機過程中引入的不確定度進行單個分量的量化評定。

2.3.1曲線校準過程引入的不確定度

2.3.1.1標準溶液配制引入的不確定度

原始標準物質引入的不確定度：標準物質給uprel出的擴展不確定度，屬于正態分布，置信概率p=95%，包含因子k=2，為B類評定，up=0.5/2=0.25uprel=up/ p=0.25/99.0=0.002 5根據上述計算公式可求得標準物質的相對不確定度為0.002 5。

標準物質稱量引入不確定度umxrel標準物質的稱量質量為0.010 0 g，使用XS205電子天平稱量，該天平經計量檢定為Ⅰ天平，檢定分度值為0.1 mg，依據JJG 1036—2008 《電子天平檢定規程》［24］稱量范圍0≤m≤5 g時最大允許誤差為±0.05 mg（0.5e），按照均勻分布計算，為B類評定。則其不確定度為相對標準不確定度為：umxrel=umx/mx=0.002 9。

標準儲備溶液定容引入的不確定度uVsrel：按照JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》［25］，20 ℃時，500 mL容量瓶（A級）最大允許誤差為±0.25，滿足均勻分布，k=，為B類評定。由量器校準引入的不確定度為：uml=0.25/=0.144 mL，相對不確定度為umlrel=uml/m=0.144/500=0.000 3容量瓶在20 ℃條件下檢定校準，因溶劑體積受溫度變化的影響遠大于各量器自身，因此僅考慮前者。標準儲備液在（20±2）℃條件下配制，溶劑為甲醇，20 ℃時甲醇體積膨脹系數為α=0.2×10-3℃-1。按照均勻分布，則因溫度變化引起溶劑體積改變的標準不確定度為uV=ΔV/，ΔV=V×ΔT×α，溫度對體積影響引入的標準不確定度為1.2/=0.692，相對標準不確定度為uTrel=0.692/500=0.001 4。標儲溶液定容過程相對不確定度合成為

標準溶液稀釋引入的不確定度uVWrel，由量器校準和環境溫度變化引起溶劑體積改變引入不確定度組成：（1）量器校準引入的相對不確定度uVWlrel

標液稀釋過程中所使用量器見表1，參考JJG196—2006［25］和JJG 646—2006《移液器檢定規程》［26］要求，依據相應最大允許誤差，計算得每次定容量器校準的相對標準不確定度見表1，具體步驟同umlrel，則合成相對不確定度為：

表1　量器校準引入的不確定度Table 1 Uncertainties caused by container calibration

（2）環境溫度變化引起溶劑體積改變引入的相對標準不確定度uV2rel

標液稀釋過程中所用溶劑為甲醇，實驗溫度為（2 0±2）℃，計算過程同uTrel，各相對標準不確定度見表2，則合成相對不確定度為：

標準溶液配制過程中由原始標物、標物稱量、標儲定容、標液稀釋引入的相對不確定度合成為：

表2　環境溫度變化引入的不確定度Table 2 Uncertainties caused by environmental temperature changes

2.3.1.2標準工作曲線擬合引入的不確定度u（xpred）rel

配制甲基睪酮的7 個不同質量濃度標準溶液（0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg/mL），對標準溶液和被測溶液分別用液相色譜測試1 次，得到相應的峰面積A，采用最小二乘法擬合，得到標準工作曲線的線性回歸方程Y=aX+b（b為截距，a為斜率）和方程的線性相關系數如表3所示。

表3　甲基睪酮標準曲線測定結果Table 3 Standard curves of methyltestosterone

依據校準數據，結合由用來導出校準曲線的軟件提供的出殘余標準誤差s，由y的（隨機）變化性，預估計值xpred的不確定度可計算得，由標準工作曲線擬合引入的相對不確定度為0.000 02，為A類評定。

式中：s為由軟件給出的殘余標準誤差；xpred為被測溶液的估計值，用被測溶液的平均值表示；為繪制工作曲線的全部x值的平均值；p為對被測溶液質量濃度進行的測定次數；n為對標準溶液質量濃度進行測定的次數。

2.3.1.3曲線校準過程引入的不確定度u（cal）rel

曲線校準過程中由標準溶液配制和標準工作曲線擬合引入的相對不確定度合成為：

2.3.2樣品質量引入的不確定度umrel

樣品的稱量質量為5.00 g，使用賽多利斯TE212-L電子天平稱量，該天平經計量檢定為Ⅲ級天平，依據檢定證書和JJG 1036—2008《電子天平檢定規程》［24］，該天平檢定分度值為0.1 g，稱量范圍0.2 g≤m≤5 g時最大允許誤差為按照均勻分布計算，為B相對標準不確定度為：

2.3.3樣品加標過程引入的不確定度ualrel

目標樣品用10～1 000 μL移液器向鱈魚空白基質樣品中加入1 000 μL質量濃度為4 μg/mL的標準工作液制備而成，實驗溫度為（20±2）℃，計算過程同uVsrel，為B類評定。由此產生的標準不確定度為ual=5.773 7 μL，相對不確定度為ualrel=5.773 7/1 000=0.005 8。

樣品前處理過程中產生的不確定度屬于A類評定，采用回收率6 個平行樣品（鱈魚、鯉魚、鳙魚樣品各2份）添加回收率的相關數據進行計算。回收率分別為 79.3%、77.6%、79.7%、75.7%、76.3%、75.5%。根據回收率平均值（ec）的標準差的相對標準不確定度采用平均值的相對標準偏差：

平行樣品提取樣液中藥物質量濃度分別為3.39、3.18 μg/mL，提取樣液定容體積1.00 mL，樣品質量5.00 g，檢測結果分別為678、636 μg/kg，平均值回收率校正因子校正，樣品中甲基睪酮殘留量檢測結果分別為877、823 μg/kg，平均值

2.3.5由定容體積引起的不確定度uVrel

樣品使用1 mL移液器加入1.0 mL流動相定容。流動相的主要組成為甲醇，實驗在（20±2）℃條件下進行，為B類評定，計算過程同uVsrel，樣品定容引人的相對不確定度為uVrel=0.006 0。

2.3.6由液相色譜儀引入的不確定度uuvwrel

根據儀器檢定證書，整機定量重復性RSD6=0.12%，為B類評定。

測試過程隨機效應通過樣品的重復測定進行不確定度評定，屬于A類評定。測定樣品中甲基睪酮殘留量，檢測結果分別為678、636 μg/kg，平均值按照矩形分布處理，則測試過程隨機效應導致的標準不確定度和相對標準不確定度分別為：

2.4合成不確定度及擴展

合成不確定度采用方和根法，即將各個標準不確定度分量平方后求其和再開根。因不確定度分量較多且其大小也比較接近時，估計為正態分布，選95%的包含概率時，包含因子取k=2，對不確定度進行擴展。

2.4.1合成相對標準不確定度urel

將測試過程中由曲線校準、稱量質量、樣品加標、定容體積、樣品前處理過程、液相色譜儀、隨機效應引入的相對不確定度合成為：w=（850±79）μg/kg；k=2。

2.4.2合成相對擴展不確定度Urel

在95%置信水平下，k=2時，試樣甲基睪酮含量測定的相對擴展不確定度為：Urel=k×urel由實驗數據的平均值計算試樣中甲基睪酮含量w=（850±79）μg/kg，故其標準不確定度為擴展標準不確定度為U=k×u=0.093 0×850=79.0 μg/kg。

2.5測量結果報告

目標樣品甲基睪酮含量測試結果表示為w=（850±79）μg/kg；k=2。無論是給出擴展不確定度還是標準不確定度，通常不確定度的有效數字不多于兩位。測試結果應根據所給出的不確定度進行修約。

2.6各影響因素的不確定結果

各影響因素的不確定結果見表4。

表4　各影響因素的不確定度結果Table 4 Uncertainty evaluation for the determination

3　結 論

對實驗結果進行不確定度評定時要考慮試驗過程的每個環節，但不是所有不確定度的來源都有評估其不確定度所需的數據，且這些來源也不一定是獨立的，如抽樣方法、樣品的均一性、樣品的儲存條件、樣品的影響、空白修正、方法的偏差等，可依據實際情況篩選進行取舍。當被測量值在法規給出規定限值時，應當關注限值中是否給出不確定度的允許量，并在評價符合性時依據不同情況考慮分析結果的不確定度。根據t檢驗判斷平均回收率與1.0有顯著性差異，檢測結果必須經過校正。通過對試驗過程中各相對不確定度分量分析可知，試驗過程中不確定度的主要來源為測試過程的隨機效應，其次為標準校準過程，以及樣品的處理過程。因此建議在實際操作過程中增加平行樣的測定次數，不斷熟悉樣品處理過程以提高回收率，并且應盡量減少標準溶液稀釋倍數。此外，實驗室建立良好的實驗環境條件、使用高精密度和穩定性的儀器設備并定期進行檢定/校準，使用高純度的有證標準物質、開展新檢測項目時進行方法確認并選用性能參數較好的檢測方法等都將有利于提高檢測結果的準確性和可靠性。

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Uncertainty Evaluation for Determination of Methyltestosterone Residue in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Huifeng1， QI Tianhua2
（Changchun Inspection Center for Aquatic Products Safety and Quality， Changchun 130033， China）

According to the basic methods for uncertainty evaluation from Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement （JJF1059-2012） and Guidance on Evaluating the Uncertainty in Chemical Analysis （CNAS-GL-06） a mathematical model of uncertainty evaluation for the determination of methyltestosterone residue in aquatic products by HPLC was established. The sources of determination uncertainty were analyzed and each component of uncertainty was quantified. The combined standard uncertainty and expanded uncertainty were finally obtained. The major uncertainty sources were the random effects in testing process， curve calibration and sample pretreatment.

uncertainty； methyltestosterone ； high performance liquid chromatography （HPLC）； aquatic products

TS207.3

A

1002-6630（2015）18-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201518037

2014-12-19

長春市水產品質量安全風險評估專項（2014-1485）

張惠峰（1982—），女，副研究員，碩士，主要從事水產品質量安全及水環境研究。 E-mail：xiaoqiutong@126.com