超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定牛乳中3 類15 種抗生素殘留

李一凡，王鳳玲*，肖 瑤，彭 誠，鄭 玲，閆宏昊，符 楨

（天津商業大學 天津市食品與生物技術重點實驗室，生物技術與食品科學學院，天津 300134）

超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定牛乳中3 類15 種抗生素殘留

李一凡，王鳳玲*，肖 瑤，彭 誠，鄭 玲，閆宏昊，符 楨

（天津商業大學 天津市食品與生物技術重點實驗室，生物技術與食品科學學院，天津 300134）

建立牛乳中青霉素類、磺胺類、四環素類3 類 15 種抗生素殘留量同時測定的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。樣品經乙腈-水溶液（3∶1，V/V）提取、HLB固相萃取小柱凈化、氮氣吹干后用1.0 mL流動相溶解殘余物。采用ZORBAX Ecliplus C18色譜柱，乙腈和5 mmol/L甲酸銨溶液（含體積分數0.2%甲酸）作流動相梯度，質譜選擇多反應監測正離子模式測定，外標法定量。結果表明，15 種抗生素在相應的濃度范圍內線性良好，相關系數均大于0.999；在3 個不同添加水平下，平均回收率為75.1%～103.7%，相對標準偏差為1.4%～7.3%，檢出限（RSN≥3）和定量限（RSN≥10）分別為0.2～4.0 μg/kg和1.0～4.0 μg/kg。方法簡便快速、靈敏度高，適合15 種抗生素同時檢測，為牛乳中抗生素多殘留測定提供了新的方法。

超高效液相色譜-串聯質譜；抗生素；牛乳；殘留量

近年來，抗素中的青霉素類、磺胺類、四環素類作為抗菌藥被廣泛應用于養殖行業中［1］。濫用這些藥物造成牛乳嚴重污染，通過食物鏈在人體內蓄積，有些抗生素有致突變、致畸、致癌的嚴重危害，過量的抗生素將使細菌的耐藥性增強［2-7］。國際食品法典委員會、歐美國家、日本和我國對這3 類藥物的最高殘留限量都在μg/kg級水平。

目前，國內外針對乳及乳制品抗生素殘留檢測方法有很多［8-14］，分別測定這3 類化合物的超高效液相色譜-串聯質譜 （ultra high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）法也較為成熟［15-19］。然而在當今養殖行業中，同時使用多類藥物的現象較為普遍，因此建立藥物多種殘留測定的方法十分重要。雖然同時測定2 類或3 類藥物的方法亦有報道［20-22］，但同時測定上述3 類藥物在牛乳中殘留的UPLC-MS-MS法尚未見報道。本研究采用UPLC-MS-MS測定，通過優化樣品前處理及UPLC-MS-MS條件，建立了同時提取、動態多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）同時測定青霉素類、磺胺類、四環素類共3 類15 種牛乳中抗生素新方法。方法簡便快速、靈敏可靠，可為牛乳中藥物多殘留的定性與定量分析提供技術保障。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

牛乳來源于天津、黑龍江、內蒙養殖場。

阿莫西林、磺胺二甲嘧啶標準品（純度≥97%）中國獸藥監察所；氨芐西林、哌拉西林、青霉素G、苯唑西林、氯唑西林、磺胺嘧啶、金霉素、土霉素標準品（純度≥97%） 中國食品藥品檢定研究院；雙氯西林、磺胺甲基嘧啶標準品（純度≥97%） 美國Sigma公司；奈夫西林、磺胺噻唑、四環素標準品（純度≥97%） 德國Dr Ehrenstorfer公司；乙腈（色譜純）美國J.T.Baker公司；甲酸（色譜純） 美國Alfa Aesar公司；實驗室用水為超純水。

1.2儀器與設備

1200 UPLC儀、6410A三重四極桿MS儀 美國Agilent公司；ME215P電子天平 德國Sartorius公司；PHB-4 pH計 上海雷磁儀器廠；HC-2517高速離心機科大創新股份有限公司；ZH-2渦旋振蕩器 天津藥典標準儀器公司；KD200氮氣吹掃儀 杭州奧盛儀器有限公司；HG-930A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；AS10200A超聲清洗機 廣東昆山儀器有限公司；Milli-Q水純化系統 美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1提取

精密稱取4 g（精確至0.000 1 g）均質生鮮乳置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈-水（3∶1，V/V）溶液，渦旋振蕩2 min，超聲提取10 min，15 000 r/min離心10 min，將上清液過濾轉移到雞心瓶，重復提取一次，將乙腈水層合并。45 ℃減壓濃縮至3 mL左右，用乙腈-水（3∶1，V/V）溶液轉移并定容至10 mL。

1.3.2凈化

將HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL）用5 mL甲醇、5 mL水活化后，將10 mL提取液過HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5 mL水、2 mL體積分數5%甲醇溶液淋洗小柱，用10 mL甲醇洗脫，全過程控制流速不超過2 mL/min，收集洗脫液，45 ℃水浴氮氣吹干。用1.0 mL流動相定容，溶液經0.22 μm濾膜過濾后，供超UPLC-MS-MS測定。

1.3.3標準溶液的配制

1.3.3.1標準工作液配制

青霉素類標準儲備溶液：準確稱量青霉素類標準品各0.025 0 g，用乙腈-水（3∶1，V/V）溶液溶解配制成質量濃度為100.0 μg/mL的儲備液，4 ℃冰箱內避光保存，備用。

磺胺和四環素類標準儲備溶液：準確稱量標準品各0.025 0 g，用甲醇溶液配制成質量濃度為100.0 μg/mL的儲備液，4 ℃冰箱內避光保存，備用。

1.3.3.2混合標準中間工作液的配制

準確移取適量按1.3.3.1節配制的15 個100.0 μg/mL標準儲備液，配成1.0 μg/mL混合標準中間工作液，用于添加回收實驗和配制標準溶液系列，0～4 ℃條件下避光保存。

1.3.3.3混合標準溶液的配制

分別準確移取一定體積的混合標準中間工作液，可根據需要用流動相稀釋成適當質量濃度的混合標準工作液。現用現配。

1.3.4UPLC-MS-MS分析

1.3.4.1UPLC條件

色譜柱：A g i l e n t Z O R B A X E c l i p l u s C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流動相A：5 mmol/L甲酸銨溶液（含體積分數0.2%甲酸），流動相B：乙腈；梯度洗脫見表1；流速：0.2 mL/min；進樣量：15 μL；柱溫：30 ℃。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4.2MS條件

表2　15 種抗生素殘留檢測的UPLC-MS-MS儀器參數Table 2 UPLC-ESI MS-MS parameters for analysis of 15 antibiotics

離子源：電噴霧離子源，正離子模式；毛細管電壓4 000 V；霧化氣流速11.0 L/min；霧化氣壓力241.15 kPa；干燥氣溫度350 ℃；掃描方式：多反應監測模式；15 種抗生素定性離子、定量離子、碎裂電壓、碰撞能量參數見表2。

2　結果與分析

2.1方法學建立

2.1.1前處理條件優化

根據牛乳中蛋白質含量高的特點，需要選擇合適的沉淀劑去除蛋白，減小或去除干擾。分別提取這 3類化合物的方法已有國家標準［22-24］作為支持，但是否適用于15 種藥物的同時提取需要進行考察。實驗比較了不同體積比的乙腈溶液、5%高氯酸溶液、0.1 mol/L Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液、10%三氯乙酸溶液、5%磷酸溶液為提取溶劑的提取效果，發現5%高氯酸溶液，離心后溶液中有絮狀物出現，不利于凈化，且氮吹過程腐蝕性大；0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，提取液出現膠體層，離子化效率相對較低；5% 磷酸溶液提取，離心后溶液分層，上層呈油狀，旋蒸后溶液呈乳白色，不易過濾；10%三氯乙酸溶液提取離心后，所得溶液澄清，但濃縮時需要溫度較高，影響抗生素的穩定性，回收率低；乙腈-水（3∶1，V/V）和10%三氯乙酸溶液沉淀蛋白的效果較好。經MS儀測定后，采用乙腈-水（3∶1，V/V）溶液進行提取，提取效果和回收率都較高。

使用體積比為1∶1、3∶1、5∶1 乙腈-水溶液，當乙腈-水（1∶1，V/V）時，沉蛋白效果不佳，3∶1與5∶1效果相近，但3∶1時，阿莫西林和氨芐西林的提取率明顯高于5∶1。

2.1.2色譜條件的優化

實驗比較了C18和C8色譜柱對色譜分離效果和響應值的影響，C18色譜柱測定時，萘夫西林、磺胺噻唑、金霉素的響應值明顯高于C8色譜柱，且所用目標成分分離效果也優于C8柱；流動相種類和比例選擇，遵從分離效果最好、離子化效率高、MS檢測靈敏度高的原則，流動相種類比較了甲醇、乙腈和不同比例的甲醇-乙腈作為有機相，發現部分化合物在含甲醇的有機相中峰形或響應值較差。水相考察了添加不同體積分數的甲酸及甲酸銨的影響，加入甲酸可以適當減少出峰拖尾，加入甲酸銨能消除峰的前延。最終選擇含5 mmol/L甲酸銨溶液（含體積分數0.2%甲酸）為流動相A，乙腈為流動相B；考察了不同洗脫梯度對15 種抗生素的保留時間和MS圖效果影響，結果顯示，采用表1條件下洗脫梯度效果峰形對稱、半峰寬窄、豐度高，檢測時間短。

2.1.3MS條件的優化

圖1　青霉素類、磺胺類和四環素類15 種抗生素MRMM圖Fig.1 MRM chromatograms of 15 antibiotics standards

根據待測物的化學結構，均適合在ESI源正離子模式下進行離子化，其母離子為［M+H］+。將15 種標準品儲備液用流動相稀釋成質量濃度為0.5～1.0 μg/mL的標準品混合溶液。在ESI源正離子模式下，分別對待測物進行MS參數優化。根據目標物質的相對分子質量，通過MS2SIM優化碎裂電壓使［M+H］+的響應最大；對母離子作Product Ion掃描優化得到最適碰撞電壓，使定量離子MS響應值最大。利用優化后的色譜條件和MS條件，測定15 種抗生素混合標準溶液，其色譜圖MRM見圖1。

2.2線性回歸方程及檢出限

根據每種抗生素類藥物的靈敏度，用空白基質溶液配成一系列質量濃度混合標準工作溶液，在所建立的色譜條件和MS條件下測定，以抗生素峰面積對被測組分的質量濃度作圖，確定了15 種抗生素的線性范圍、線性方程，結果見表3。

表3　15 種抗生素線性范圍、線性方程、線性相關系數、檢出限和定量限Table 3 Regression equations with linear ranges and correlation coeffifi cients， and limits of detection and quantififi cation for 15 antibiotics

由表3可見，阿莫西林和苯唑西林的線性范圍是5～100 ng/mL，其他13 種抗生素的線性范圍是2～100 ng/mL；標準曲線的線性相關系數均大于0.999；方法檢出限（RSN≥3）為0.2～4.0 μg/kg，定量限（RSN≥10）為1.0～4.0 μg/kg。利用國標方法測定相同樣品，3 類抗生素的線性范圍是5～90 ng/mL，說明建立的測定方法優于國標方法。

2.3回收率實驗

在空白牛乳樣品中添加標準溶液進行回收率測定。分別添加5.0、10.0、50.0 μg/kg 3 個水平，每個水平進行5 次重復測定，回收率實驗結果見表4。

表4　15 種抗生素類藥物回收率實驗結果（n=5）Table 4 Recovery rates of 15 antibiotics in blank milk （n= 5）%

由表4可見，3 個水平平均加標回收率為75.1%～103.7%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.4%～7.3%，利用國標方法測定相同樣品，3 類抗生素的加標回收率范圍為69.8%～102.7%。結果表明，所建立的方法可以同時測定牛乳中3 類15 種抗生素殘留，并且回收率優于國標方法的測定。

2.4實際樣品測定

采用所建立的方法和國家標準［23-25］對實驗室采集到的98 個牛乳樣品進行15 種抗生素藥物殘留的檢測，均未檢出。隨機抽取98 份樣品中的5 份樣品作為空白樣品基質進行加標回收率實驗，每份樣品添加5.0 μg/kg標準品，加標回收率測定結果見表4。結果表明，加標回收率在75.3%～99.7%，人工添加的樣品中有檢出，說明建立的方法有效。

3　結 論

本實驗按照鮮牛乳中抗生素殘留檢測要求，分別對鮮牛乳樣品的前處理方法、UPLC-MS-MS條件進行了優化，確定了UPLC-MS-MS法同時測定3 類15 種抗生素殘留的檢測條件。所建立的方法克服了單類檢測的局限性，滿足分析時間短、檢出限低、線性范圍寬、回收率高的方法學要求，適合牛乳中 3 類15 種抗生素殘留同時定量分析。

［1］ 田維榮， 趙啟陽. 牛奶中抗生素殘留檢測研究進展［J］. 畜牧與飼料科學， 2012， 33（5/6）： 81-83.

［2］ 何繼軍， 王彪. 牛奶中抗生素殘留的檢測分析［J］. 中國農業科技導報， 2009（11）： 59-61.

［3］ 張文虎， 張瑞梅. 牛奶中抗生素殘留及其速測方法［J］. 新疆畜牧業， 2009（4）： 27-29.

［4］ 張彩紅， 索寶， 李正紅， 等. 牛奶中抗生素殘留的危害及控制對策［J］.中國動物檢疫， 2009（5）： 63-65.

［5］ 馮建成， 張容鶴. 乳制品中抗生素殘留現狀及［J］. 現代商貿工業，2008（9）： 367-368.

［6］ 李國柱， 陳灝， 張廣源. 動物源性食品中磺胺類藥物殘留的危害及監控對策［J］. 廣東畜牧獸醫科技， 2013（4）： 30-32.

［7］ 陳懷宇， 黃周英， 林育騰. 牛乳中抗生素的殘留與危害現狀［J］. 泉州師范學院學報， 2004， 22（6）： 102-106.

［8］ 曹亢， 曹雪， 任發政， 等. 牛奶中抗生素殘留檢測方法的研究進展及展望［J］. 中國乳業， 2009（9）： 62-65.

［9］ 王宏博， 高雅琴， 杜天慶， 等. 牛奶中抗生素殘留的危害及檢測方法的研究進展［J］. 畜牧與飼料科學， 2010， 31（4）： 158-160.

［10］ 鄭維君， 常煒， 馬文宏， 等. 牛奶中抗生素殘留檢測的研究進展及應用現狀［J］. 食品研究與開發， 2010， 31（5）： 187-190.

［11］ AGUILERA-LUIZ M M， VIDAL J L M， ROMERO-GONZáLEZ R，et al. Multi-residue determination of veterinary drugs in milk by ultrahigh-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A， 2008， 1205： 10-16.

［12］ JUAN C， MOLTó J C， MA?ES J， et al. Determination of macrolide and lincosamide antibiotics by pressurised liquid extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry in meat and milk［J］. Original Research Article Food Control， 2010， 21（12）： 1703-1709.

［13］ 陳卓婧， 閻淑男， 夏瀾， 等. 農產品中青霉素殘留檢測技術研究進展［J］.浙江農業科學， 2013（11）： 1476-1479.

［14］ 劉博， 曹小妹， 宋合興， 等. 畜產品中四環素類抗生素殘留的檢測技術［J］. 飼料博覽， 2012（12）： 33-38.

［15］ 孫玉增， 徐英江， 劉慧慧， 等. 液相色譜-串聯質譜法測定海產品中21 種磺胺類藥物殘留［J］. 食品科學， 2010， 31（2）： 120-123.

［16］ 陳家越. 牛奶中抗生素殘留檢測技術的研究進展［J］. 廣州化工，2012， 40（10）： 8-10.

［17］ 張愛芝， 王全林. 超高效液相色譜-串聯質譜多組分檢測牛奶中外源性激素殘留［J］. 食品科學， 2010， 31（6）： 208-212.

［18］ 殷居易， 謝東華， 李左卿， 等. HPLC-APCI（+）MS/MS分析動物源性食品中的硝基咪唑類藥物殘留量［J］. 分析測試學報， 2007，26（3）： 385-388.

［19］ 孟靜， 王銳， 祝建華. 生鮮牛乳中抗生素檢測方法的新問題［J］. 中國乳品工業， 2010， 38（9）： 42-44.

［20］ 劉正才， 楊方， 余孔杰， 等. 超高效液相色譜-串聯質譜法快速檢測鰻魚中磺胺類、喹諾酮類、四環素族抗生素藥物殘留［J］. 食品科學， 2009， 30（14）： 167-170.

［21］ 王文輝， 劉慧艷， 王鈺玉， 等. 牛奶中抗生素殘留快速檢測方法分析［J］. 中國乳品工業， 2011， 39（7）： 53-55.

［22］ 陳曉汀， 王陸迪. 一種新型快速的牛奶抗生素檢測系統［J］. 農業質量標準， 2009（4）： 37-38.

［23］ 段文仲， 賈海濤， 艾連峰， 等. GB/T 22975—2008 牛奶和奶粉中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和雙氯西林殘留量的測定： 液相色譜-串聯質譜法［S］. 北京： 中國標準出版社， 2009.

［24］ 呂紅英， 段文仲， 陳瑞春， 等. GB/T 22966—2008 牛奶和奶粉中16種磺胺類藥物殘留量的測定： 液相色譜-串聯質譜法［S］. 北京： 中國標準出版社， 2008.

［25］ 郭春海， 竇彩云， 陳瑞春， 等. GB/T 22990—2008 牛奶和奶粉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定： 液相色譜-紫外檢測法［S］. 北京： 中國標準出版社， 2008.

Simultaneous Determination of 15 Antibiotics Residues in Milk by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

LI Yifan， WANG Fengling*， XIAO Yao， PENG Cheng， ZHENG Ling， YAN Honghao， FU Zhen
（Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnoloy， College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin 300134， China）

A new approach for the simultaneous determination of residues of three classes of antibiotics， i.e.， penicillins，sulfoamides and tetracyclines， in milk by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLC-MSMS） was established. Samples were extracted with acetonitrile-water （3：1， V/V）， cleaned up using an HLB SPE cartridge and blown to dryness under nitrogen and the residues were then dissolved in 1.0 mL of mobile phase. A total of 15 analytes were separated on ZORBAX Ecliplus C18column with a mobile phase composed of acetonitrile and 5 mmol/L formic ammonium acetate solution containing 0.2% formic acid with gradient elution， detected by ESI-MS/MS and quantifi ed by the external standard method. The correlation coefficients of the linear calibration curves were over 0.999 in the corresponding concentration range. The average recoveries of the 15 analytes ranged from 75.1% to 103.7%， with relative standard deviations （RSDs） at three spiked concentrations of 1.4%-7.3%. The limit of detection （LOD， RSN≥3） and quantifi cation（LOQ， RSN≥ 10） were 0.2-4.0 and 1.0-4.0 μg/kg， respectively. The new method is simple， fast， sensitive and reliable， and it is suitable for the determination of antibiotic residues in milk.

ultra high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry； antibiotics； milk； residues

TS207.5

A

1002-6630（2015）18-0204-05

10.7506/spkx1002-6630-201518038

2014-11-20

李一凡（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：421338431@qq.com

王鳳玲（1965—），女，高級實驗師，碩士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：wfl ing@tjcu.edu.cn