明膠、阿拉伯膠復合凹土制備乳酸菌微膠囊研究

馮云琪

（淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇淮安 223001）

明膠和阿拉伯膠均為具有良好生物親和性的天然高分子材料，明膠是一種蛋白質，阿拉伯膠是一種多聚糖，均可作為微膠囊制備的理想壁材。在pH=4左右，明膠帶正電荷較多，阿拉伯膠帶負電荷較多，可中和形成復合物，再加入固化劑，形成交聯狀的網狀結構而成囊 （孫燕婷等，2013）。凹土是一種天然非金屬粘土礦物質，具有特殊纖維晶體形態結構，具有較好的生物親和性，其本身可作為益生菌載體，當在微膠囊壁材中添加該物質時，又可較好地提高微囊的機械強度和通透性（趙玉萍等，2013、2012）。本試驗以載菌凹土為芯材，以明膠、阿拉伯膠復合凹土作為壁材制備微囊膠，研究該壁材對益生菌在胃腸環境中的保護作用，旨在為飼料用益生菌制劑的制備提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 乳酸桿菌由江蘇省生物質轉化與過程集成工程實驗室篩選保藏；凹土由江蘇省凹土資源利用重點實驗室提供；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、胃蛋白酶、胰蛋白酶購自日本Sigma公司；其他試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

722N型可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；JJ-1型精密增力電動攪拌器（金壇市榮華儀器制造有限公司）；TGL-16G-A型臺式高速冷凍離心機 （上海安亭科學儀器廠）；BSD-YX3200型立式雙層智能精密搖床 （上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；BL-50A型立式壓力蒸汽滅菌鍋 （上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；90-3型恒溫雙向磁力攪拌器（上海振榮科學儀器有限公司）。

1.2 培養基及人工胃腸液的配制 乳酸桿菌的培養基為MRS培養基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏 5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨 2 g，乙酸鈉 2 g，葡萄糖 20 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，吐溫-801 mL，水 1000 mL，pH 6.2 ～6.4（趙玉萍和方芳，2013）。

人工胃液：胃蛋白酶10g，NaCl 2 g，加水定容至 1000 mL，pH 2.5（趙玉萍等，2013）。

人工腸液：胰蛋白酶 10 g，KH2PO46.8 g，加水定容至 1000 mL，pH 6.8（李寧，2007）。

人工胃腸液均用0.2 μm濾膜過濾備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 凹土的純化 將未經處理的凹土研磨，過200目篩，以10%的量加入去離子水，磁力攪拌器攪拌24 h后，靜置4 h，取中間層凹土懸液，以10%的量加入去離子水，重復3次（趙玉萍等，2012）。

1.3.2 復凝聚法制備乳酸菌微膠囊

1.3.2.1 復凝聚法制備乳酸菌微膠囊方法 乳酸菌在MRS培養基中于37℃靜置培養，2000 r/mim離心 10 min，取沉淀備用（趙玉萍等，2013）。

載菌凹土的制備：適量菌懸液和凹土在pH 6.5，35℃吸附40 min，冷凍干燥備用（趙玉萍等，2015；Rong 等，2008）。

微囊的制備：將適量明膠、凹土、載菌凹土和Tween-80于40℃混合，攪拌均勻，恒溫加入阿拉伯膠溶液，繼續攪拌均勻，用稀鹽酸溶液調節pH至3.6～4.0。

微囊的固化：上述混合液自然冷卻至25℃左右，再以冰浴冷卻至10℃以下，加入一定量戊二醛固化劑，攪拌15 min后，用10%NaOH溶液調pH至8～9，繼續攪拌至膠囊析出（于樂軍，2009）。

微膠囊的收集：離心收集并洗滌固化后的微膠囊產品。

1.3.2.2 明膠-阿拉伯膠復合凹土微囊制備的適宜條件的確定 適宜菌膠比例的確定：明膠-阿拉伯膠膠體質量總濃度為4%（質量比為1∶1），凹土0.2%，pH 4.0，于25℃反應 20 min，菌膠質量比例分別為 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9（菌體的量為載菌凹土的質量），考察其對乳酸菌微膠囊包埋率以及模擬胃腸環境的釋放率的影響。

在單因素試驗中，明膠-阿拉伯膠復合膠體用量分別為2%、3%、4%、5%、6%，其質量比分別為1.5∶1、1.2∶1、1∶1、1∶1.2、1∶1.5， 凹 土 用 量 分 別 為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%， 反應溫度分別為15、20、25、30、35 ℃，凝聚 pH 分別為 3.6、3.7、3.8、3.9、4.0，反應時間分別為 10、20、30、40、50 min。

1.3.2.3 微膠囊質量初步評價 包埋率按以下公式計算：

活菌數測定采用菌落總數計數法。

包埋前活菌數計數：取包埋前的菌液，稀釋到適當倍數后取0.2 mL涂布，37℃培養48 h，計數。

未包埋活菌數計數：取微膠囊離心上清液，用無菌水洗滌數次，收集上清和洗滌液稀釋到適當倍數后取0.2 mL涂布，37℃培養24～48 h，計數。

1.3.2.4 耐胃腸環境試驗 將1 g微膠囊置于100mL人工胃液中，于37℃水浴恒溫振蕩150r/min，分別于0、l、2、3 h進行活菌計數，然后將微膠囊于2000 r/min離心10 min并經生理鹽水洗滌后，轉至100 mL人工腸液中，于37℃水浴恒溫振蕩150 r/min， 分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進行活菌計數。同時與未經包埋的菌體與載菌凹土作對照（尹尉翰等，2011）。

2 結果與討論

2.1 菌膠比的確定 菌膠比對微囊包埋率影響較大，若菌膠比過高，菌體過量，壁材不能將菌體完全包裹；若菌膠比例過低，壁材過量，雖然包埋率高，但因包埋過于致密不利于菌體釋放。菌膠比對乳酸菌微膠囊包埋率的影響結果如圖1所示。

圖1 菌膠比對包埋率的影響

由圖1可以看出，隨著菌膠比的不斷減小，微膠囊的包埋率不斷增大。當菌膠比為1∶5時包埋率最低，為70.1%；菌膠比為1∶9時包埋率最高，為79.5%。當菌膠比從1∶5降低到1∶8時，微膠囊粒徑有所減小，包埋率明顯提高，達79.3%，但隨著菌膠比的降低，微膠囊包埋菌體量亦逐漸降低，綜合包埋率和包埋量兩個因素，確定菌膠比為 1∶8。

2.2 明膠-阿拉伯膠復合膠體用量的確定 壁材濃度過低或過高均會影響微膠囊產品的外觀均勻度和圓整性。若明膠-阿拉伯膠復合膠體用量過少，形成的微膠囊量少，包埋率亦隨之下降，若用量過多，加入戊二醛后會形成凝膠狀而非微膠囊。復合膠體用量對包埋率影響結果如圖2所示。

圖2 復合膠體用量對微膠囊包埋率的影響

由圖2可以看出，隨著復合膠體用量的不斷增大，微膠囊的包埋率先增大后減小，當復合膠體用量為4%時，包埋率最大為79.9%。可能是當復合膠體濃度較低時，膠體電離電荷較少，能夠形成的微膠囊數量少，包埋率亦較低；隨著復合膠體濃度的增大，兩者電離電荷增加，因此能夠形成的膠囊數量增加，包埋率增大；當明膠-阿拉伯膠復合膠體的濃度大于5%時，由于復合膠體濃度過高、黏度較大，形成的微膠囊相互粘連，導致包埋率也隨之下降。

2.3 適宜明膠-阿拉伯膠質量比的確定 由圖3可知，隨著明膠-阿拉伯膠質量比的增加，微膠囊的包埋率先增加后減小，當明膠∶阿拉伯膠為1∶1時，包埋率最大為90.4%，可能是因為明膠所帶正電荷和阿拉伯膠所帶負電荷恰好完全中和。

圖3 明膠-阿拉伯膠質量比對微膠囊包埋率的影響

2.4 適宜凹土用量的確定 載菌凹土減少了復凝聚過程中菌體的損失，在壁材中添加凹土會增加微膠囊的機械強度（趙玉萍等，2012）。凹土用量對包埋率的影響結果如圖4所示。

圖4 凹土添加量對微膠囊包埋率的影響

由圖4可知，隨著凹土用量的不斷增加，微膠囊的包埋率先增大后減小。當凹土用量為0.4%時，包埋率最高為91.1%，再增加凹土用量包埋率反而下降，原因可能是隨著凹土用量的增加，降低了成囊性。

2.5 適宜復凝聚反應時間的確定 足夠的反應時間會使明膠-阿拉伯膠凹土復合體系反應充分，可將菌體盡可能地充分包埋，保證了形成的微膠囊數量，結果如圖5所示。

圖5 反應時間對微膠囊包埋率的影響

由圖5可以看出，隨著復凝聚反應時間的增加，微膠囊包埋率逐漸增加后趨于穩定，當反應時間為10 min時，包埋率已達到92.4%。

2.6 適宜凝聚pH的確定 在不同的pH條件下，明膠和阿拉伯膠帶電性質不同，交聯反應程度不同，試驗結果如圖6所示。

圖6 凝聚pH對微膠囊包埋率的影響

由圖6可以看出，當pH在3.9時，微膠囊的包埋率最高，為93.6%。可能是因為pH為3.9時，明膠所帶的正電荷最多，而阿拉伯膠此時帶負電荷，因此形成的微膠囊量也最多（于樂軍，2009）。

2.7 適宜反應溫度的確定 低溫時復凝聚反應不易發生，因為明膠溶液呈凍凝狀，阿拉伯膠溶液黏度較大；高溫時，分子熱運動速率較快，且不易凝聚在載菌凹土周圍，因此會影響微膠囊的形成，所以適宜的反應溫度會對微膠囊的包埋率產生影響，結果如圖7所示。

圖7 反應溫度對微膠囊包埋率的影響

由圖7可以看出，隨著溫度的升高，微膠囊的包埋率先升高后下降，溫度為25℃時，包埋率最高，為93.3%。

2.8 微膠囊在模擬胃腸環境中的釋放率 按上述方法和步驟制得乳酸菌微膠囊，經冷凍干燥后獲得活菌制劑。將未經任何保護的乳酸桿菌、負載在凹土上的乳酸桿菌和微膠囊制劑在模擬人工胃腸環境下進行試驗，0～3 h為模擬胃環境，3～15 h為模擬腸環境。由圖8可知，在胃環境中載菌凹土和微膠囊釋放比率接近，但在腸環境中，微膠囊能較長時間地保持活菌比率，證明明膠-阿拉伯膠-凹土復合壁材對于乳酸菌具有較好的保護作用。

圖8 人工腸胃環境下活菌釋放率與時間的關系

3 結論

本試驗以明膠、阿拉伯膠復合凹土作為壁材，以載菌凹土作為芯材，制備乳酸桿菌微膠囊制品，經人工模擬胃腸環境作用發現，載菌凹土與微膠囊在胃環境中的乳酸桿菌的釋放率接近，但在腸環境中，微膠囊中的乳酸桿菌卻能在很長時間保持活性，說明本試驗中所用的壁材對乳酸桿菌具有較好的保護作用。在微膠囊的制備過程中，與僅以明膠、阿拉伯膠作為壁材的微膠囊相比，本試驗所用的膠體總量、交聯pH、固化時間和溫度等參數均發生了變化，尤其是膠體用量從15%降為4%，但仍可保持較高的包埋率，節約了成本。可能是因為凹土的添加，其表面的電荷影響了明膠、阿拉伯膠的表面電荷，從而使固化條件均發生了變化，關于這方面的機理有待進一步深入研究。

[1]李寧.雙歧桿菌微膠囊制備工藝及功能特性的研究：[碩士學位論文][D].保定：河北農業大學，2007.

[2]孫燕婷，黃國清，肖軍霞，等.阿拉伯膠/殼聚糖復凝聚相的制備及表征[J].中國食品學報，2013，13（2）：43.

[3]尹尉翰，雷涵，徐宇虹.海藻酸鈣微囊對乳酸乳球菌在胃腸道環境中的保護作用[J].微生物學通報，2011，38（8）：1228 ～ 1234.

[4]于樂軍.明膠/阿拉伯膠復凝聚微膠囊技術用于乳酸菌保護的研究：[碩士學位論文][D].青島：中國海洋大學，2009.

[5]趙玉萍，方芳.應用微生物學實驗[M].南京：東南大學出版社，2013.11.

[6]趙玉萍，黃穎娟，吳潔，等.以凹土為載體的新型益生菌制劑的制備[J].食品工業科技，2013，34（19）：141 ～ 144.

[7]趙玉萍，唐梓鑫，楊莉，等.凹土對乳酸球菌的吸附條件優化[J].食品與機械，2015，1：46 ～ 49.

[8]趙玉萍，徐巖，王棟.固定化耶氏酵母提高產γ-癸內酯能力[J].食品工業科技，2012，33（6）：230 ～ 233.

[9]Rong X M，Huang Q Y，He X M，et al.Interaction of pseudomonas putida with kaolinite and montmorillonite：a combination study by equilibrium adsorption，ITC，SEM and FTIR [J].Colloids and surfaces B：Biointerfaces，2008，64：49 ～ 55.■