miR-186對C2C12中myogenin基因表達的抑制研究

蘇 欣

（白城職業技術學院，吉林白城 137000）

骨骼肌分化是一個復雜并且嚴格的程序化過程，由中胚層細胞定向分化成成肌細胞，然后成肌細胞增殖，不可逆地退出細胞周期，最終由單核前體細胞融合形成多核體細胞 （肌管）（Sabourin和Rudnicki，2000）。在這個復雜的過程中，肌肉調節因子（MRFs）起到重要的調節作用。MRFs屬于堿性螺旋-環-螺旋 （bHLH）轉錄因子家族，包括Myf5、MyoD、Myf6 和 myogenin （Yun 和 Wold，1996），其中myogenin在骨骼肌分化的后期起到重要的調節作用（Pownall等，2002）。 Myogenin基因敲除小鼠出生后由于骨骼肌發育嚴重缺陷致死，其肌細胞不能融合形成多核的肌纖維（Hasty等，1993）。有報道稱下調內源myogenin基因的表達可以抑制C2C12成肌細胞的分化（Mastroyiannopoulos等，2012）。

miRNAs是一類高度保守的，長約22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可結合于靶基因mRNA的3’-UTR區，促進其mRNA降解或抑制轉錄（Bartel，2009）。 大量研究指出，miRNAs可調節肌細胞生成過程中相關基因和轉錄因子的表達，如miR-148可通過抑制ROCK1基因而促進肌肉分化 （Zhang等，2011），miR-27可通過調節PAX3而影響成肌進程（Crist等，2009）。本試驗旨在研究miR-186對C2C12成肌細胞中myogenin基因的調節作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑 鼠源成肌細胞C2C12，購自中國科學院上海生化所干細胞庫。

主要試劑：DMEM（Hyclone）、胎牛血清（FBS，Gibco）、馬血清（Gibco）、谷氨酰胺（Invitrogen）、細胞裂解液（Promega）、TRNzol-A+reagent（天根，北京）、熒光素酶報告分析系統 （Promega）、抗體myogenin（abcam）、GAPDH（武漢三鷹）、山羊抗兔和山羊抗小鼠HRP標記的二抗（碧云天）。

1.2 細胞培養及處理 細胞培養及誘導分化：將C2C12細胞等密度接種于6孔板，用生長培養基培養（GM，含10%濃度的胎牛血清），培養細胞長至70% ～80%密度時，換成分化培養基（DM，含2%濃度的馬血清）于37℃、5%CO2培養箱中培養1～4 d，誘導其分化。

細胞轉染：將100 pmol的miRNA mimic、antimiR和陰性對照miRNA與X-tremeGENE 9轉染試劑（Roche）加入到Opti-MEM培養液中（Invitrogen）。24 h后，將構建的小鼠野生型 myo genin 3'-UTR熒光素酶質粒和對照質粒用脂質體3000（Invitrogen）分別轉染至細胞。

1.3 RNA提取及反轉錄成cDNA 使用miR-cute miRNA提取分離試劑盒（天根，北京）對收獲的細胞進行RNA提取。然后用cDNA第一鏈合成試劑盒（天根，北京）制備合成cDNA。

1.4 實時熒光定量PCR （qRT-PCR） 使用BioEasy SYBR Green I實時 PCR試劑盒（Bioer Technology，杭州）對上述反轉錄得到的cDNA進行qRT-PCR檢測，反應體系為25 μL。反應條件如下：

95℃預變性 3 min，95℃變性 10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40個循環。使用BIORAD iQ5 Multicolor Real-Time PCR檢測系統進行擴增和檢測，每個樣本重復3次。

1.5 蛋白質提取及蛋白質印跡 取出細胞，棄掉培養液，PBS清洗2次，每孔加入200 μL的細胞裂解液，在冰面上裂解10 min后吸取至離心管，冰上繼續裂解 10 min，4℃、12000 r/min離心 10 min，吸取上清。用BCA法測定蛋白質濃度，取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，恒壓80 V電泳約2 h。然后在90 V的條件下電轉膜1.5 h，將蛋白轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入相應的一抗 （myogenin稀釋濃度為1∶2000；GAPDH的稀釋濃度為 1∶4000）4℃孵育過夜。TBST洗滌NC膜3次，每次室溫搖動洗滌10 min。加入HRP標記的兔抗小鼠或羊抗兔IgG抗體（稀釋濃度均為1∶2000），室溫搖動 1 h，再用 TBST洗滌NC膜3次，每次室溫搖動洗滌10 min。ECL化學發光后分析結果。

1.6 熒光素酶活性分析 在細胞轉染24 h后收獲并裂解細胞，使用熒光素酶活性分析試劑盒分析熒光素酶活性，經酶標儀定量后與標準化的熒光素酶表達對照進行對比分析得到結果。

1.7 統計分析 數據采用SPSS 11.5軟件進行統計分析，P＜0.05表示統計學差異顯著。

2 結果與分析

2.1 C2C12細胞分化過程中miR-186的變化將C2C12細胞用生長培養基（GM）培養，培養至80% ～90%密度后，換成分化培養基（DM）培養，在1～4 d時分別收取細胞并對其中miR-186的表達量進行檢測。結果表明，miR-186在剛剛換至分化培養基的第1天時表達顯著增加（P＜0.05），并隨著分化完成（第2～4天）表達量逐漸下降（P＜0.01或 P ＜ 0.05）（圖 1）。

圖1 miR-186在C2C12細胞中的表達

2.2 miR-186抑制C2C12細胞分化過程中myogein基因的表達 為了研究miR-186是否可調節內源myogenin水平，將miR-186 minics和miR-186抑制劑（amiR-186）分別轉染入經分化培養基（DM）誘導分化1 d的C2C12細胞中，通過Western Blot檢測到C2C12細胞中內源myogenin的蛋白水平，與陰性對照miRNA相比，miR-186可以明顯抑制分化中的C2C12細胞的myogenin水平，而amiR-186則反之（圖2）。

圖2 miR-186對誘導分化的C2C12中myogenin蛋白的調節

2.3 miR-186通過與myogenin的3'-UTR區結合抑制myogenin 為了檢測miR-186是否作用于myogenin的3'-UTR，將小鼠myogenin的3'-UTR區插入到熒光素酶基因下游后轉入293t細胞中。結果顯示，與單獨轉入myogenin的3'-UTR區，或者同時轉入myogenin 3'-UTR區和miRNA陰性對照（miR對照）相比，轉入miR-186可以有效地抑制約60%的熒光素酶活性 （P＜0.05）（圖3）。說明miR-186通過作用于myogenin的3'-UTR區來抑制myogenin。

3 討論與結論

圖3 熒光素酶分析檢測miR-186對myogenin的3'-UTR的作用

miR-186在C2C12細胞分化前期顯著上調，隨著分化的逐漸完成，miR-186的表達量也隨之下降，這說明miR-186對C2C12細胞分化存在著某種調控作用。同時，本試驗證明miR-186結合于myogenin的3'-UTR區從而抑制其表達。由此可見，miR-186可能通過抑制myogenin基因的表達而抑制C2C12成肌細胞的分化過程。

盡管miR-186在骨骼肌和心肌中表達影響肌肉分化，但是miR-186并不是肌肉特異性表達的，也有文獻指出miR-186在癌細胞的細胞周期調 節 中 起 作 用 （Cai等 ，2013；Zhou 等 ，2008）。miR-186存在于ZRANB2基因的第8和第9外顯子之間的內含子中，其表達與ZRANB2基因的表達呈正相關性，而ZRANB2廣泛表達于多種組織中（Adams等，2001）。

本試驗結果表明，miR-186在C2C12細胞誘導分化初期表達上調，并且是myogenin的調節子，能通過作用于myogenin的3'-UTR區抑制myogenin的表達，從而抑制肌細胞的分化。

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