阿勒泰羊脂肪酸合成酶及脂蛋白酯酶基因的序列分析

楊莉等

摘要：以阿勒泰羊為研究對象，對脂肪酸合成酶（FAS）基因、脂蛋白酯酶（LPL）部分編碼區的cDNA進行克隆、測序，與GenBank中已收錄的其他11種動物的FAS、LPL基因序列進行同源性分析，并構建分子進化樹。結果顯示，所克隆的FAS、LPL基因與綿羊的基因序列同源性最高，分別為99.61%、100.00%；FAS基因與虎鯨同源性最低，為46.24%；LPL基因與羅非魚的序列同源性最低，為56.28%。結果均正確地反映了物種間的進化關系，序列分析結果為人們進一步對阿勒泰羊脂肪的相關研究、肉質性狀的研究及育種提供了理論基礎，同時也為阿勒泰羊FAS、LPL基因的生物學功能、遺傳進化研究提供了分子依據。

關鍵詞：硬脂酰輔酶A去飽和酶；脂肪酸合成酶；脂蛋白酯酶；序列分析；阿勒泰羊

中圖分類號： S811.3；Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0043-03

新疆阿勒泰地區位于中國西北邊陲，冬季長達半年，許多優良綿羊品種無法適應阿勒泰地區異常寒冷的氣候條件，而阿勒泰羊以其全身肌肉豐滿、體型肥碩、尾根附近沉積大量脂肪、耐粗飼、抗寒性強等特點，能夠適應阿勒泰地區異常寒冷的氣候條件，成為當地的優良類群[1]。脂肪酸的合成是由脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成甘油三脂（TAG）[2]，FAS表達水平的高低能夠直接影響甘油三脂在體內的沉積[3]，因此FAS是脂肪酸合成代謝的關鍵酶。Hsu等分離得到人脂肪酸合成酶代謝調控基因，發現人的脂肪酸合成酶基因位于17q25[4]。Kameda等對鵝脂肪酸合成酶代謝調控基因作了研究，發現脂肪酸合成酶代謝調控基因全序列長度大約有 50 kb，同時現已知牛的基因位于19q22、雞的基因位于18號染色體上[5]。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）是機體脂質和脂蛋白代謝的關鍵酶，是分解循環脂蛋白中乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯，釋放出脂肪酸和甘油的限速酶[6]，作為影響脂肪沉積的一個重要遺傳標記，研究LPL表達水平對加快肉品質改進速度具有重要的意義。本研究對阿勒泰羊的FAS、LPL基因部分片段進行了克隆、測序，并與已報道的其他物種的相應基因進行序列分析，以期在分子水平的基礎上為家畜的改良育種提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

選擇新疆福海縣5只健康成年的阿勒泰羊，采集阿勒泰羊頸部肌間脂肪、胸部肌間脂肪、腹部肌間脂肪、腿部肌間脂肪、尾部脂肪、肝臟等6個部位的組織，立即放入液氮罐速凍，轉入-80 ℃冰箱中保存。

TRIzol、DEPC、DNA marker、Taq PCR Master Mix，購自天根生物科技服務有限公司；PrimeScript@RT reagent kit反轉錄試劑盒（批號：RR047A），購自TaKaRa公司（批號：DRR420A）；DNA凝膠回收試劑盒（批號：DP209-02）、胰蛋白胨、瓊脂粉、瓊脂糖、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇，購自北京華美生物工程公司；感受態細胞E.coli DH5α由石河子大學動物科技學院傳染病實驗室保存。

1.2試驗方法

1.2.1目的基因引物設計以GenBank中已發布的綿羊FAS基因（登錄號：NM_001009254.1）、LPL基因（登錄號：NM_001009394.1 ）為模版，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，由北京六合華大基因有限公司合成。FAS基因上游引物：5′-CCTCGGTGCCCGTTGTCTAC-3′；下游引物：5′-TGCTGCTCAAAGGATGTGTC-3′；目的片段長度為256 bp。LPL基因上游引物：5′-GATTAGCGATTCCTACTTCAGC-3′；下游引物：5′-AGACTTGTCATGGCATTTCAC-3′；目的片段長度為181 bp。

1.2.2RNA的提取利用TRIzol一步法提取試驗樣品的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量，于-70 ℃保存備用。然后依次加入以下試劑：1 μg RNA、10× Reaction buffer、1 μL MgCl2、1 μL DNase Ⅰ（RNase-free），用DEPC處理水補足至10 μL，除去存在的少量基因組 DNA。于37 ℃反應 30 min，然后加入1 μL 50 mol/L EDTA，65 ℃孵化10 min，即可用此RNA作為反轉錄模板。以RNase-free水為對照，用紫外分光光度計測定D260 nm/D280 nm值、總RNA濃度。

1.2.3反轉錄向提取純化好的各組織的總RNA中加入以下試劑：2 μL 5×gDNA Eraser bufferⅠ、1 μL 5 xgDNA EraserⅠ、1 μL總RNA，用無核酸酶水補足至10 μL。然后于42 ℃孵育混合物3 min，冷卻后向下旋轉混勻，將管子放回冰上。再向以上反應液中按指定順序加入如下試劑：4 μL無核酸酶水Ⅰ、4 μL 5×PrimeScript buffer 2、1 μL RT Prime MixⅠ、1 μL Prime Script RT Enzyme MixⅠ，終體積為20 μL。加完樣后輕柔混合，短暫離心，然后于37 ℃孵育混合物30 min，最后于85 ℃加熱5 s終止反應。反轉錄產物可直接用于PCR擴增，或于-20 ℃保存（3個月以內），長期保存建議放于-70 ℃。

1.2.4目的基因PCR反應及克隆測序利用常規PCR反應對組織樣品中FAS、LPL基因進行擴增，將目標片段分別從瓊脂糖凝膠中切下，按照DNA回收試劑盒說明回收目的片段，在T4-DNA連接酶作用下，經16 ℃過夜連接PGEM-T Easy載體，用CaCl2法將連接產物轉入大腸桿菌E.coli DH5α感受態細胞，經藍白斑篩選陽性菌落后，挑取單菌落進行培養，然后從菌液中提取質粒，菌液送往上海華大基因科技有限公司測序。

1.2.5基因序列分析采用DNAMAN軟件對GenBank中綿羊、山羊、牛、豬、斑馬魚、褐家鼠、馬等11個物種和測序后的阿勒泰羊FAS、LPL基因的編碼區核苷酸序列進行同源比對分析。用MEGA5.1軟件構建進化樹，進行遺傳進化分析。

2結果與分析

2.1提取總RNA

提取的總RNA經紫外分光光度計測定，D260 nm/D280 nm在1.8～2.0間，表明提取的總RNA無蛋白質和苯酚污染，純度較高，可用于后續試驗。

2.2FAS基因的RT-RCR擴增

以RNA反轉錄的cDNA為模板，以FAS、LPL的上、下游引物擴增，分別得到256、181 bp的條帶（圖1、圖2）。

2.3FAS、LPL基因測序結果與序列分析

將阿勒泰羊的FAS基因核苷酸序列與已公布的綿羊的相應序列進行分析比對，結果顯示序列同源性為99.61%；通過與GenBank數據庫中綿羊、牛、小鼠等11個物種進行核苷酸序列比對發現，阿勒泰羊FAS基因與綿羊的序列同源性最高，與西農薩能奶山羊的序列同源性最低；與牛、馬、人、豬、褐家鼠的序列同源性均在80%～95%之間；與鴿、雞的序列同源性分別為72.66%、71.88%；與虎鯨的序列同源性最低，為46.24%（表1）。結果與傳統分類相一致。

2.4系統發育樹分析

采用MEGA 5.0軟件構建了FAS基因系統發育樹。從圖3可以看出，大分支分為2類，虎鯨為1個分支；其余10個物種聚為一大類，首先禽類的鴿子和雞成為一類，后與馬、褐家鼠以及人、豬聚成的小類合成一類，最后與平行的哺乳綱偶蹄目的綿羊、阿勒泰羊、山羊以及西農薩能奶山羊以及牛聚為一大類。

從LPL的基因系統發育樹中可以看出，主支分為2支，第1主支以阿勒泰羊、牛、馬、人、雞等11個物種組成，另1支為羅非魚。其中第1主支又分為5個分支，第1分支為阿勒泰羊與綿羊；第2分支主要為山羊、牛、貓、馬；第3分支為東非狒狒、人；第4分支為小家鼠、豚鼠；第5分支為雞（圖4）。

3討論

脂肪的合成代謝與分解代謝始終處于一個平衡狀態，主要是由甘油三酯的酯化、分解這2個過程主導，其相對速度決定了脂肪的分解或儲存。FAS是脂肪合成的關鍵酶，LPL可以催化乳糜微粒、極低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，因此對FAS、LPL基因的研究有助于深入了解脂肪代謝的分子機制。

有關人、鼠、豬、牛等哺乳動物 FAS 基因的結構、定位、表達研究已有報道[7-9]，從序列分析可以看出，阿勒泰羊FAS基因與羊亞科的西農薩能奶山羊的序列同源性較低，這可能與地理環境的差異有關。Krichgessner等從綿羊脂肪組織中克隆測序得到1 656 bp的部分LPL基因序列[10-11]；為獲得綿羊全長LPL基因，Bonnet等通過3′-RACE方法獲得了1 917 bp的綿羊LPL基因序列[12]，并與Edwards等獲得的 LPL基因序列拼接后得到共3 529 bp的綿羊LPL全長cDNA序列，通過Southern Blotting方法定位在綿羊第2號染色體上。本試驗克隆測序阿勒泰羊LPL基因的cDNA發現，與GenBank中收錄的9種哺乳動物中LPL基因cDNA序列表現了較高的同源性及進化上的保守性。

采用MEGA5.0 軟件構建了FAS與LPL基因的系統進化樹，進化樹上分支節點越近，說明基因序列間遺傳距離也相對較近；11個物種構建的系統進化樹表明FAS基因中阿勒泰羊和綿羊具有最近的遺傳關系，而與虎鯨的親緣關系最遠，LPL基因與羅非魚的親緣關系較遠，其結果均正確地反映了物種間的進化關系。

隨著分子生物學技術的出現和不斷成熟，人們從分子生物學水平對脂肪代謝的調控進行了一些探索性的研究，而本研究獲得了阿勒泰羊FAS、LPL基因的部分序列，為人們進一步對阿勒泰羊脂肪相關的研究和肉質性狀的研究以及育種提供了理論基礎，同時也為今后研究阿勒泰羊與牛亞科等近緣物種間分子進化和遺傳分化奠定了一定的理論基礎。

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