應(yīng)用正交測(cè)驗(yàn)法優(yōu)選巨菌草誘導(dǎo)培養(yǎng)基

黃靜等

摘要：以巨菌草幼莖作為試驗(yàn)材料，研究不同濃度的防褐化物質(zhì)對(duì)巨菌草組織培養(yǎng)褐化的影響，應(yīng)用正交測(cè)驗(yàn)法研究生長(zhǎng)激素2，4-D、KT、IAA不同的濃度對(duì)巨菌草愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：最佳防褐化物質(zhì)是1.0 mg/L PVP；2，4-D對(duì)巨菌草幼莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響最小，KT居于二者之間，沒(méi)有達(dá)到顯著水平，而IAA影響最大，達(dá)到了顯著水平（P<0.05）；巨菌草誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方是MS+2，4-D 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L。

關(guān)鍵詞：巨菌草；防褐化；正交測(cè)驗(yàn)法；愈傷組織；培養(yǎng)基；激素

中圖分類號(hào)： S646.904文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0074-03

收稿日期：2014-09-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心開(kāi)放基金（編號(hào)：JCJJ13003）。

作者簡(jiǎn)介：黃靜（1988—），女，山東泗水人，碩士研究生，研究方向?yàn)椴輼I(yè)育種學(xué)。Tel：（0591）83789338；E-mail：hj880866@126.com。

通信作者：鄭燕，博士，副教授，從事草業(yè)育種學(xué)研究。Tel：（0591）83789338；E-mail：swallow1318@126.com。巨菌草（Pennisetum sp.）屬于單子葉植物禾本科狼尾草屬，是一種適宜在熱帶、亞熱帶和溫帶生長(zhǎng)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌草。其抗逆性強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，為直立叢生的多年生植物，植株高大，一般為3～5 m，有的也可達(dá)到6～8 m[1-2]。巨菌草是典型的C4植物，光合效率很高，是其他闊葉樹(shù)的4～7.46倍，年產(chǎn)鮮草達(dá)200～400 t/hm2[3]。巨菌草原產(chǎn)于南非，1983年引入我國(guó)，并由于其巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值得到了廣泛推廣。

巨菌草是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的菌草，抗逆性極強(qiáng)，一般不會(huì)有病蟲(chóng)害發(fā)生，管理簡(jiǎn)單，利用期長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度快，粗蛋白含量很高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[3]，可作為生產(chǎn)飼料和保持水土、綠化環(huán)境的優(yōu)良草種[4]，也被用作香菇、靈芝、平菇、猴頭菇等的栽培培養(yǎng)料[5]。此外，巨菌草還是能源草的典型草種，可用于生產(chǎn)乙醇等生物燃料。巨菌草種植簡(jiǎn)單，既可以進(jìn)行有性繁殖，也可以進(jìn)行無(wú)性繁殖。無(wú)性繁殖一般用腋芽進(jìn)行，有性繁殖用種子，但是發(fā)芽率一般都很低[4]。目前，巨菌草在我國(guó)南方的種植范圍越來(lái)越廣，由于不耐寒，在北方寒冷的冬季無(wú)法自然越冬，使得在北方的推廣受到嚴(yán)重限制[6]。

長(zhǎng)期以來(lái)，巨菌草品種選育方面基本是依靠常規(guī)育種的方法，因而無(wú)法快速解決巨菌草耐寒性、品質(zhì)及產(chǎn)量改良等問(wèn)題。植物基因工程技術(shù)是解決品種改良的一種高效手段，而完整的巨菌草組織培養(yǎng)體系是對(duì)其進(jìn)行基因工程遺傳改良的前提和技術(shù)保障。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)巨菌草組織培養(yǎng)體系構(gòu)建的報(bào)道。本研究擬參考其他禾本科植物如甘蔗、雜交狼尾草、絨毛狼尾草等的組織培養(yǎng)方法，優(yōu)選巨菌草誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為巨菌草品種改良提供試驗(yàn)依據(jù)，也為其更大范圍的應(yīng)用和推廣提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為巨菌草幼莖，由福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心提供。

1.2方法

1.2.1外植體的準(zhǔn)備及消毒選取幼嫩并且生長(zhǎng)良好的巨菌草莖稈，用75%乙醇逐層擦拭較老的葉鞘表面并剝除直至所需要材料的前2層，用刀切下莖尖部分，然后置于2%次氯酸鈉中消毒10 min，用無(wú)菌水沖洗3～ 5次，在無(wú)菌濾紙上吸干水分[7]。

1.2.2防止褐化為了防止外植體的褐變，采用組織培養(yǎng)中常用的活性炭（activated carbon，AC）和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）2種防褐化物質(zhì)，在相同培養(yǎng)基下添加不同濃度的2種物質(zhì)，觀察對(duì)巨菌草出愈率的影響[8]。所用培養(yǎng)基組合如表1所示。

表12種防褐化物質(zhì)濃度設(shè)計(jì)

處理編號(hào)防褐化物質(zhì) 濃度（ mg/L）Ⅰ1AC0.1Ⅰ2AC0.2Ⅰ3AC0.3Ⅰ4PVP0.5Ⅰ5PVP1.0Ⅰ6PVP1.5注：基本培養(yǎng)基均為MS+2，4-D 3.0 mg/L。

用手術(shù)刀把莖尖分生組織部分切成0.1～ 0.2 cm厚的小薄片，接種于表1中培養(yǎng)基上，每瓶接種6塊外植體，3次重復(fù)。然后置于26～28 ℃的暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[9-10]，10 d后比較出愈情況，運(yùn)用Excel 和統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3正交測(cè)驗(yàn)法篩選最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方采用L9（33）正交設(shè)計(jì)，使用的正交表如表2所示[8]，設(shè)置3個(gè)影響因子，分別為2，4-D、KT和IAA。基本培養(yǎng)基為MS，3種激素 2，4-D、KT 和IAA各設(shè)3個(gè)濃度水平，2，4-D濃度為1.0、2.0、3.0 mg/L；KT濃度為0.5、1.0、1.5 mg/L；IAA濃度為 0.1、 0.2、0.3 mg/L[7，9，11-12]。共9個(gè)處理，每個(gè)處理接種3瓶，每瓶5塊外植體，3次生物學(xué)重復(fù)（時(shí)間重復(fù)），統(tǒng)計(jì)愈傷率，運(yùn)用Excel 和DPS進(jìn)行方差分析和差異顯著性測(cè)驗(yàn)，確定最佳激素組合。

2結(jié)果與分析

2.1不同防褐化物質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表3可看出，在相同培養(yǎng)基MS+2，4-D 3.0 mg/L下，采用不同濃度的防褐化物質(zhì)AC與PVP對(duì)巨菌草幼莖愈傷組織誘導(dǎo)的效率明顯不同。用AC作為防褐化物質(zhì)時(shí)，不同濃度下出愈率雖然有變化，但差異不顯著；用PVP作為防2種不同防褐化物質(zhì)AC與PVP相比，采用PVP比AC產(chǎn)生的出愈率明顯更高（表3）。從圖1可以看出，巨菌草幼莖在接種10 d后，培養(yǎng)基加入PVP的外植體已經(jīng)長(zhǎng)出一點(diǎn)愈傷組織，而培養(yǎng)基加入AC的外植體還沒(méi)有長(zhǎng)出愈傷組織。特別是采用濃度為1.0 mg/L的PVP產(chǎn)生的出愈率最高，故本研究都采用此濃度。