蝴蝶蘭高效組培快繁及溫室移栽技術

張偉等

摘要：為優化蝴蝶蘭組培快繁及小苗溫室移栽技術，研究以蝴蝶蘭花梗段側芽為外植體的高效快繁技術。在MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 g/L 花寶1號培養基中誘導出營養芽，2個月誘導率達90%；而用VW+3.0 mg/L 6-BA+1.0 g/L花寶1號+10%香蕉泥培養基誘導出花葶，2～3個月誘導率達80%。利用誘導的無菌營養芽、花葶節段切片在MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+10%椰子汁+30 mg/L 檸檬酸培養基中，2個月誘導出叢生芽，再利用小塊叢生芽分化增殖叢生芽，1.5個月增殖率可達6倍。當芽長超過1.5 cm時，在1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+0.2%活性炭培養基中壯苗生根，2個月后小苗長出3條以上的根，根長超過1.5 cm，于智能溫室煉苗3～4周后移栽。應用該小苗移栽試驗方法，經統計3個月后成活率可達95%。

關鍵詞：蝴蝶蘭；花梗側芽；營養芽；花葶；叢生芽

中圖分類號： S682.31文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0083-04

收稿日期：2014-10-12

基金項目：河南省平頂山市農業科學院自選項目。

作者簡介：張偉（1977—），男，陜西漢中人，助理研究員，主要從事現代農業生物技術組培的研究。E-mail：zhw9380@163.com。蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）別稱蝶蘭，被譽為“洋蘭皇后”，是熱帶蘭中的珍品[1]。蝴蝶蘭花朵碩大、朵數多、開花期長、花色艷麗、色澤豐富，可盆栽放置于書房、客廳、臥室等處，典雅大方并給人以美的享受，花朵可作新娘的捧花、襟花、胸花，同時是切花的好材料[2]。蝴蝶蘭是蘭科植物中栽培最廣泛、普及程度最高的品種之一，深受各國人民喜愛。蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，植株極少發育側枝，且種子極難萌發，實生苗變異嚴重，不適于大規模商業種植。應用植物組培快繁技術可在短期內生產大量整齊一致的種苗，因此大規模商業種植一般采用組織培養快繁的方法[3]。關于蝴蝶蘭組織培養的報道較多[4-7]，多以蝴蝶蘭的葉片[8]、莖尖[8-9]、花梗腋芽[8-11]、種子[12]、根尖[8]、花梗節間[13]為外植體進行組織培養研究，而對以花梗為外植體的研究常采用未開花、即將開花的花梗，這對母株傷害較大，將影響其觀賞價值、經濟價值[14]。本試驗于蝴蝶蘭開花3個月后（農歷正月之后）采摘花梗，盡量減少對其觀賞價值、經濟價值的影響。以蝴蝶蘭叢生芽途徑開展組培快繁，具有誘導率高、誘導時間短、叢生芽增殖率高（可達6倍）、技術難度低、遺傳性能穩定等優點，可避免生產中發生大量變異，對大規模生產具有重要意義[15]。在前人研究的基礎上，開發出一套成熟、先進的蝴蝶蘭組培快繁及溫室移栽技術，以期為相關生產及研究提供參考。

1材料與方法

1.1供試蝴蝶蘭

供試蝴蝶蘭采自河南省平頂山市農業科學院農業生物技術實驗室智能溫室，于2013年3月至5月初采取，品種為寶龍皇后。

1.2外植體

供試外植體為蝴蝶蘭花梗節間側芽，以及花梗段側芽誘導出的無菌營養芽和花葶，以營養芽和花葶作為組培快繁試驗材料。

1.3消毒過程

剪取蝴蝶蘭母株近基部花梗，將花梗切割為2～3 cm長的切段，每個花梗切段帶1個節間側芽，每節距側芽上部1 cm、下部2 cm。消毒時先用洗潔精與自來水清洗30 min，于超凈工作臺中用75%乙醇浸泡30 s，再用0.1%HgCl2溶液浸泡13 min，倒掉HgCl2并用無菌水沖洗4～6遍。消毒后切去花梗段兩端少許部分，按照正常生長方向將花梗節段插入供試培養基。

1.4供試培養基

基礎培養基為MS、VW、1/2 MS。采用不同質量濃度植物生長調節劑的培養基進行誘導與增殖，并進行壯苗生根培養，培養環境為：溫度（25±2） ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照時間12 h/d。篩選出5種主要培養基（20.0 g蔗糖、6.0 g瓊脂粉、pH值5.6～5.8）。誘導培養基（A）：MS+30 mg/L 6-BA +1.0 g/L花寶1號+30 mg/L檸檬酸；誘導培養基（B）：VW+3.0 mg/L 6-BA+1.0 g/L花寶1號+100 g/L香蕉泥 +30 mg/L檸檬酸+1.0 g/L活性炭；分化培養基（C）：MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+10%椰子汁+30 mg/L 檸檬酸；壯苗生根培養基（D）：1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭。

1.5小苗煉苗和移栽

將準備移栽的試管苗不揭蓋連瓶置于溫室3～4周煉苗。移栽時用水苔作栽培基質，所有操作工具和水苔均消毒滅菌。移栽前先將水苔用清水浸泡12 h，甩干后方可使用。移栽時打開封口膜，小心夾出小苗，洗凈根部培養基，于0.2%高錳酸鉀溶液中浸泡幾分鐘后撈出，用甩干的水苔包住小苗根部，放入穴盤中；將移栽好的小苗穴盤放置于白天溫度22～30 ℃、夜晚溫度18～25 ℃、相對濕度65%～85%、光照度低于10 000 lx、潔凈通風的環境中。移栽結束后用2 000倍多菌靈殺菌劑對小苗統一噴灑，2周1次，連續噴灑3次；第1周保持每天上午、下午2次噴霧增濕，第2周后澆水并且每1～2周施用1次均衡肥料，于3個月時統計。

2結果與分析

2.1技術路線

試驗流程見圖1、圖2。

2.2花梗芽的誘導

利用花梗段側芽在誘導培養基中誘導營養芽和花葶，培養2～3個月即可獲得；培養過程中若培養基消耗過多或褐化嚴重則轉接1次，培養基不變，連續3個月進行統計（表1）。由表1可見，MS、VW 2種基礎培養基均可作為誘導培養基，但添加不同質量濃度的激素、添加物使2種基礎培養基誘導出不同的植物組織；因此，不能表明某一培養基更適合作為誘導基礎培養基。使用相同基礎培養基，同時使用 6-BA、NAA時誘導率比單獨使用6-BA時低，且萌動出芽時間長。當6-BA的濃度達到5.0 mg/L時，誘導率略下降且生長偏弱，表明此濃度或更高濃度并不適于蝴蝶蘭花梗側芽的誘導；單獨使用3.0 mg/L濃度的6-BA時，蝴蝶蘭花梗側芽誘導率較好。本試驗中A培養基（表1中2號培養基）外植體誘導表現突出，出芽最早且出芽率達到90 %，萌動僅需 12 d，形成營養芽需要2個月左右；VW培養基加入100 g/L香蕉泥、1.0 g/L花寶1號后，大多數誘導出花芽，其中B培養基（表1中5號培養基）的出芽率達到80 %，形成可誘導分化叢生芽的花葶需2～3個月。表1不同培養基對花梗側芽誘導的結果

序號基礎培養基激素濃度（mg/L）6-BANAA外植體數

（個）萌動出芽

時間（d）誘導率

（%）備注1MS1.00.1201835大部分為營養芽，出芽緩慢2MS3.00.0201290絕大部分為營養芽，生長健壯3MS5.0 0.5 201475大部分為營養芽，生長偏弱4VW1.00.3202030部分為花芽，生長較弱5VW3.00.0201580部分為花芽，出芽較快，生長健壯6VW5.00.0201770部分為花芽，生長偏弱注：所有培養基均添加1.0 g/L花寶1號、30 mg/L檸檬酸；VW誘導培養基均添加100 g/L香蕉泥。

2.3叢生芽的分化和增殖

將誘導出的營養芽從花梗節段基部切下，在各培養基中進行叢生芽分化增殖，于3個月時統計（表2）。由表2可見，營養芽分化增殖時MS培養基優于VW培養基。NAA濃度為0.5 mg/L、6-BA濃度為1.0～7.0 mg/L時營養芽分化的叢生芽增殖率逐漸提高；6-BA濃度為5.0 mg/L時誘導分化的平均出芽數較多，且生長健壯；6-BA濃度為7.0 mg/L時誘導分化的平均出芽數最多，但有部分畸形。可見，6-BA濃度過高并不能達到良好效果，只有6-BA、NAA在適宜濃度下配合使用，才能取得最好的營養芽分化增殖效果。C培養基（表2中Ⅱ號培養基）最適于營養芽分化再增殖，其分化出的芽數多、生長快、健壯、無畸形，且芽的生長均能成為小苗，最早1.5個月可見芽，但分化出增殖叢生芽需2個月左右；分化出叢生芽后采用多芽增殖并仍使用C培養基，可極大縮短增殖周期，僅需1.5個月。表2不同質量濃度6-BA培養基中營養出芽數（個）生長情況ⅠMS 1.00.530812.7增殖少，芽生長緩慢，長勢不好ⅡMS5.00.5302167.2增殖多，芽生長快，健壯ⅢMS7.00.5302357.8增殖多，芽生長快，有畸形ⅣVW1.00.530571.9增殖少，芽生長緩慢，長勢一般ⅤVW5.00.5301755.8增殖多，芽生長快，健壯ⅥVW7.00.5302016.7增殖多，芽生長快，有畸形注：培養基中均添加10%椰子汁、30 mg/L檸檬酸。

將花梗段側芽誘導出的花葶節部橫向切割為0.5～0.8 cm 的切片，按生長方向接入C培養基，約2個月可見小芽叢，分化增殖情況與營養芽增殖情況相似。

2.4小苗壯苗生根

當芽生長至1.5 cm時將其切下，轉入D培養基中壯苗生根，約30 d可見生根，50 d長出3條以上根，2個月根長超過1.5 cm，則可進行煉苗。

2.5小苗移栽及栽培管理方法

小苗煉苗時，試管瓶不揭蓋煉苗3～4周，移栽時挑選煉過苗的蝴蝶蘭組培苗，要求其無污染、葉數3～5張、葉寬1.5～2.5 cm、葉子健壯、葉色翠綠、根數3條以上、根長0.8～3.0 cm、根系粗壯有活力、單軸莖較明顯。小苗移栽后1周內不澆水，盡量以噴霧方式供給水分，以便小苗及早生根，同時可避免幼嫩小苗出現軟腐病害，使小苗根部充分生長，但要保持較高的濕度；第2周即可澆水，當小苗水草表面干燥，且觀察透明穴盤內下部無水滴水霧，即可澆透水；第3周后可施用液肥，施肥間隔期為1周1次，開始時采用較低肥料濃度，隨后逐漸提高，但不可過高，小苗前期常施用N ∶P2O5 ∶K2O為 20% ∶20% ∶20% 的肥料，濃度為3 000～4 000倍液，施肥時應薄肥勤施。當小苗長出新葉、新根即為成活，3個月時的成活率可達95%以上。

3結論與討論

蝴蝶蘭一般通過有性繁殖、無性繁殖2種方式進行繁殖，有性繁殖多為雜交或自交苗，遺傳性狀不穩定，不能表現出優良的母本性狀，且花色、花期不易控制，因此蝴蝶蘭快繁通常采用無性繁殖[16]。蝴蝶蘭植株極少發育側枝，比其他種類蘭花更難以進行常規無性繁殖，無法大量生產[17]，組織培養是蝴蝶蘭快速繁殖的主要手段[18-20]。在組織培養中，可通過誘導原球莖途徑進行植株再生[21]，也可利用叢生芽途徑快速繁殖，后者是從芽到芽的增殖，無需通過誘導原球莖分化不定芽來穩定遺傳母本的特征特性，從而可降低后代發生變異的概率[22]。本試驗采用從芽到芽的增殖途徑，利用花梗芽誘導出的營養芽、花葶組織來誘導分化叢生芽，減少變異且分化時間短，大幅縮短了繁殖周期。

試驗過程中第1次分化誘導使花梗段側芽充分利用，不破壞母株并盡可能保存母體，達到商業種植的高效利用；叢生芽分化出來后的每次分化增殖過程均比第1次分化誘導過程縮短一半時間，1.5個月即可增殖6倍左右，其他資料中尚未見如此高的增殖倍數[16]。

由培養基的成分及外植體的培養過程可知，6-BA是誘導側芽萌發的主要因子，這與譚文澄等的觀點[19]一致。向VW培養基中添加香蕉泥、花寶1號可能是花梗側芽誘導成花葶的主要因素，有待進一步研究證實。檸檬酸可有效抑制酶促褐變，通過降低褐變死亡率以提高誘導效率[23]，整個試驗中向培養基添加30 mg/L檸檬酸效果顯著，能夠減少褐化。試驗首次將營養芽、花葶節切片于相同培養基、相同環境下誘導分化出叢生芽；營養芽誘導分化叢生芽的關鍵點為莖基部，將營養芽底部和花梗節段接觸的部分切割后培養才易誘導出叢生芽，叢生芽一般從營養芽基部的短縮莖分化出來，應注意保存該部位；將試管花葶節部上下切割為0.5～0.8 cm 的切片，注意保留節部，按自然生長方向放入培養基中才能誘導分化出大量節間叢生芽，沒有節部的花葶組織一般無法分化出叢生芽。分化增殖培養基中的椰子汁同樣是增殖的關鍵因素之一，從生產角度考慮，椰子汁含量為10%時增殖倍數、增殖時間、經濟效益均為最佳。進行壯苗生根時，一般培養基只使用NAA或IBA進行生根，而本試驗添加少量6-BA可使小苗健壯生長并生根，提前進入煉苗階段。小苗移栽時，用02%高錳酸鉀溶液浸泡小苗幾分鐘，既能殺菌消毒，又可使小苗傷口快速氧化愈合，從而提高成活率，此結論經實踐總結得出。組培苗于春季移栽，若栽培管理得當第2年春節即可開花。

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