黃瓜綠斑駁花葉病毒熒光納米顆粒試紙條的研制

曹冬梅等

摘要：以黃瓜綠斑駁花葉病毒為檢測對象，應用黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異性抗體，以稀土熒光納米顆粒為標記物，制備黃瓜綠斑駁花葉病毒熒光納米顆粒試紙條，建立高效、靈敏、準確檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的熒光免疫技術體系，旨在研發一種可用于快速、便捷檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的檢測方法。

關鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒；熒光納米顆粒；試紙條；免疫層析

中圖分類號： S436.421.1+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0152-02

黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是葫蘆科作物上重要的植物檢疫性病毒，主要分布在歐洲、印度和日本等，嚴重威脅著西瓜、甜瓜、黃瓜等葫蘆科作物的生產，一般減產約15%[1]。2005年遼寧省蓋州市西瓜感染了黃瓜綠斑駁花葉病毒，損失慘重，此后在廣西、遼寧、河北、山東、廣東和北京等地陸續發現疫情，已嚴重威脅西瓜、甜瓜、黃瓜等作物的生產，因此加強該病毒的檢測極為重要?？焖贆z測技術是有效防止黃瓜綠斑駁花葉病毒疫情擴散的重要保障，而現有檢測該病毒的方法多為酶聯免疫吸附（ELISA）法，該方法可在短時間內檢測大量樣品，但對檢測環境、人員素質及設備等條件要求較高，且血清價格昂貴，不能滿足現場快速檢測的需要。此外，人們先后研究出多種快速診斷方法，如聚合酶鏈式反應RT-PCR[2]、免疫捕獲RT-PCR（IC-PT-PCR）[3]、實時熒光RT-PCR[4]等，但這些分子生物學檢測方法均具有費用昂貴、操作繁瑣的缺點，不能滿足一線檢測人員或田間檢測的需求。因此，本研究以黃瓜綠斑駁花葉病毒為檢測對象，應用黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異性抗體，以稀土熒光納米顆粒為標記物，制備黃瓜綠斑駁花葉病毒免疫層析試紙條，建立快速、靈敏、準確檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的熒光免疫技術體系。

1材料與方法

1.1材料

牛血清白蛋白（BSA）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；羊抗鼠IgG購自中晶生物技術有限公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜購自美國Millipore公司，所用試劑均為分析純。熒光納米顆粒購自深圳易瑞生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1黃瓜綠斑駁花葉病毒單克隆抗體的制備參照曹潔等的方法[5]。

1.2.2單克隆抗體的純化將腹水20 000 g離心 30 min，取上清，往所得上清中逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，室溫攪拌30 min，將液體置于4 ℃冰箱中靜置過夜；4 ℃，10 000 g離心30 min，棄上清，用pH值為7.4的PBS重懸沉淀，將所得溶液用Protein A柱進行純化，用PBS（pH值為7.4）濾洗所得產物3次，往透析后的產物中加入海藻糖，使海藻糖的終濃度為5%，100 μL/支分裝待用。

1.2.3抗體與顆粒共價偶聯取熒光顆粒50 μL，用 50 mmol/L MES（pH值為6.0）洗滌顆粒2次，每次1 mL；用600 μL 50 mmol/L MES（pH值為6.0）重懸顆粒；加入100 mg/mL sulfo-NHS和EDC各200 μL，室溫搖動30 min；離心，棄上清；用1 mL 50 mmol/L MES（pH值6.0）洗滌顆粒1次；用1 mL 50 mmol/L MES（pH值6.0）重懸顆粒；加入適量純化后的黃瓜綠斑駁花葉病毒單克隆抗體，室溫振搖1 h；加入等體積的PBS-BSA（BSA含量2%，pH值7.4），繼續反應1 h；離心，棄上清；用50 mmol/L MES（pH值6.0）洗滌顆粒3次，1 mL/次；用300 μL重懸液[10 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、10%蔗糖]重懸顆粒，4 ℃保存，備用。

將單抗梯度稀釋后，分別取50、100、150、200、250、300 μg單抗溶液，按上述方法與熒光納米顆粒偶聯，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測偶聯后的上清中抗體的濃度并篩選出最佳抗體濃度。

1.2.4試紙條的裝配用點膜儀在結合墊上噴涂單抗-熒光納米顆粒偶聯物，在硝酸纖維素膜上按照1 μL/cm的量噴涂1.5 mg/mL 黃瓜綠斑駁花葉病毒單抗和1 mg/mL 羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質控線。依次將硝酸纖維素膜、結合墊、樣品墊，吸收墊粘貼于PVC襯板上，其中結合墊、吸收墊均與硝酸纖維素膜部分重疊，分別與硝酸纖維素膜重疊約 2 mm，樣品墊部分重疊于結合墊上，二者重疊約4 mm；粘貼好后切成4 mm寬的試紙條，將制備好的試紙條置于密封袋中，加干燥劑，密封，4 ℃保存。

1.2.5檢測方法取1 g葉片于潔凈塑料袋中，加入3 mL PBST（1×PBS，0.5%Tween20，pH值7.4），揉搓塑料袋中的葉片，取汁液進行檢測。

往反應杯中加入200 μL提取物，插入試紙條，繼續反應5 min，紫外光下肉眼觀察結果。

1.2.6試紙條特異性檢測采用小西葫蘆花葉病毒（ZYMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、番木瓜環斑病毒（PRSV）、南瓜花葉病毒（SqMV）、煙草環斑病毒（TRSV）、甜瓜壞死斑點病毒（MNSV）和黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）作為特異性檢測的參照，測試方法同上。

1.2.7穩定性檢測將試紙條放在37 ℃下7 d，每天檢測陽性樣品，觀察其穩定性。

1.2.8與膠體金試紙條靈敏性對比試驗采用40 nm膠體金參考Frens的方法[6]制備膠體金試紙條。用PBST按8、16、32、64、128倍稀釋同一份陽性樣本，分別用膠體金和熒光顆粒試紙條進行檢測。

2結果與分析

2.1單克隆抗體的效價

間接酶聯法測定小鼠腹水抗體效價為1 ∶1 000 000。

2.2抗體的最佳濃度

將單抗梯度稀釋后，分別取50、100、150、200、250、300 μg單抗溶液與50 μL的1 mg/mL納米顆粒偶聯，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測偶聯后上清中抗體的濃度，取上清中抗體濃度剛好升高的前1個濃度為最佳抗體用量。本試驗確定150 μg與50 μL顆粒共價偶聯為佳。

2.3熒光納米顆粒試紙條制備的最佳條件

通過對檢測線和質控線包被條件等條件進行優化，最終確定最佳免疫層析體系：隨著二抗包被濃度的增加，檢測線的亮度也逐漸增加，在達到1.5 mg/mL后亮度不再明顯增加，因此確定檢測線的最佳包被條件為1.5 mg/mL的二抗。圖1為優化后的檢測線；隨著二抗包被濃度的增加，質控線的亮度也逐漸增加，在達到2.5mg/mL后亮度不再明顯增加，因此確定質控線的最佳包被條件為2.5 mg/mL的二抗。圖2為優化后的質控線。

2.4特異性

用制備的熒光納米顆粒試紙條檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒、小西葫蘆花葉病毒等9種植物病毒的陽性樣本，除黃瓜綠斑駁花葉病毒外，其余均無交叉反應。典型試驗結果如圖3所示。

2.5穩定性試驗

將試紙條放在37 ℃下7 d，檢測不同濃度的陽性樣品，觀察其穩定性。試驗結果證實，試紙條在37 ℃下放置7 d，靈敏性沒有明顯降低，表明其穩定性較好。

2.6靈敏度對比試驗結果

2.6.1膠體金試紙條的制備隨著單抗-膠體金偶聯物添加量的增加，檢測線和質控線的信號越來越強，添加量在0～6 μL之間時，信號強度明顯增強，6 μL以上信號強度依然會增強，但是不再明顯?？紤]到非特異反應等因素，將膠體金的用量定在6 μL。膠體金試紙條典型反應結果如圖4所示。

2.6.2靈敏度的對比用PBST倍比稀釋同一份陽性樣本，分別用膠體金和免疫層析方法進行檢測。其中，熒光試紙條用肉眼方式判讀，判讀結果如表1所示。從表1可以看出，熒光納米顆粒試紙條的靈敏性高于膠體金試紙條。

表1不同方法靈敏性比較

試紙條類型放大不同倍數后的靈敏性結果4倍8倍16倍32倍64倍膠體金試紙條++---熒光納米顆粒試++++-紙條（肉眼）注：+表示陽性，-表示陰性。

3結論與討論

本研究研制的熒光納米顆粒免疫層析試紙條可以在 10 min 之內得出檢測結果，大大快于傳統的PCR（1～2 h）、ELISA（1～2 h）等檢測方法，提高了檢測效率；該方法既適合單份樣品的檢測，也適合大批量樣品的快速檢測；該方法對操作者的能力要求不高，操作者只須要經過簡單培訓就可以獨立完成檢測工作；該方法不需要大型精密的試驗儀器，只需要1臺紫外燈就可以了，非常容易開展。與近幾年發展較為迅速的膠體金試紙條相比，熒光納米顆粒中含有多個熒光顆粒，具有良好的發光性能，熒光信號也遠遠強于傳統的標記物質。

黃瓜綠斑駁花葉病毒熒光納米顆粒檢測試紙條的研制成功，為黃瓜綠斑駁花葉病毒的快速檢測提供了一個極好的檢測方法，便于野外檢測的開展，為植物保護工作提供了一把利器，也為其他微生物、病毒等快速檢測方法的建立打下了堅實的基礎。

參考文獻：

[1]Hollings M，Komuro Y，Tochihara H.Cucumber green mottle mosaic virus[J]. Descriptions of Plant Virus，1975，154：4.

[2]李紅霞，白靜，陳紅運，等. 南瓜果實中黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-PCR檢測及cp基因序列分析[J]. 植物檢疫，2007，21（5）：268-270.

[3]尚海麗，周雪平，吳建祥. 免疫斑點法和免疫捕獲RT-PCR檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒[J]. 浙江大學學報：農業與生命科學版，2010，36（5）：485-490.

[4]鄧叢良，黃峰，呂玉峰，等. 實時熒光RT-PCR方法檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒[J]. 植物檢疫，2009，23（4）：29-31.

[5]曹潔，楊翠云，潘衛，等. 番茄環斑病毒單克隆抗體的制備[J]. 微生物學雜志，2007（3）：35-37.

[6]Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Physical Science，1973，241：20-22.