云南切梢小蠹氣味結合蛋白的分子對接

汪宇　孫浩　朱家穎　趙寧　楊斌

摘要：為研究云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）氣味結合蛋白（odorantbindingproteins，OBPs）參與其嗅覺識別過程的機理，基于氣味結合蛋白、綠葉揮發性物質的三維結構，采用分子對接方法對云南切梢小蠹OBP與3個綠葉揮發性物質可能的結合方式和結合能力進行模擬，結果表明，（E）-2-己烯醇較其他2個小分子而言更容易與云南切梢小蠹OBP結合，形成穩定的氫鍵。（E）-2-己烯醇與TyunOBP2結合能最低，更容易與TyunOBP2結合，TyunOBP2與小分子物質的結合，可能通過占有該蛋白與寄主氣味結合的空間或者通過改變TyunOBP2三維結構，導致TyunOBP2難以識別寄主松樹散發的氣味。

關鍵詞：氣味結合蛋白；分子對接；三維結構；云南切梢小蠹；嗅覺識別；揮發性物質

中圖分類號：5；433.5 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0132-03

以計算機為工具，通過理論模擬來指導輔助新型干擾劑分子的設計，可以避免研發干擾劑的盲目性并縮短干擾劑開發周期。例如，受體的三維結構通常用于解釋配體和受體的相互作用機制、生物化學反應過程、分子生物學數據以及設計合理的新型抑制劑等。蛋白質一小分子的分子對接是在已知的三維結構下，觀察它們之間是否可以結合并預測復合物的結合模式，把配體小分子放在受體活性位點區間，然后按照幾何互補、能量互補以及化學環境互補原則來評價配體與受體之間的關系，尋找兩者之間的最佳結合模式。不少植食性昆蟲都通過嗅覺識別來感受植物釋放的揮發性物質。參與嗅覺最重要的蛋白質包括氣味結合蛋白（OBP）、化學感受蛋白（csP）、嗅覺受體（OR）、味覺受體（GR）。氣味物質與昆蟲氣味結合蛋白（OBP）結合是云南切梢小蠹（Tomicusyunnanensis）識別氣味物質的基礎，也是引發昆蟲生理反應、行為反應的首要條件。云南切梢小蠹是我國西南地區云南松的重要害蟲，專化性較強。自然條件下，云南切梢小蠹以云南松為寄主，搜尋寄主過程中，不可避免會遇上各類非寄主植物。研究表明，非寄主闊葉樹種植物散發的綠葉氣味物質能干擾小蠹蟲識別寄主植物的能力，成為搜尋寄主的障礙。本研究選用已經克隆獲得的云南切梢小蠹氣味結合蛋白TyunOBP2為對象，將r11yunOBP2與綠葉揮發性物質進行分子對接，獲得其復合物結構模型，通過配體與受體之間相互作用能和結構分析給出氣味結合蛋白與綠葉揮發性物質的具體結合方式，闡明其干擾機制，旨在為利用非寄主植物的次生代謝產物調控云南切梢小蠹提供理論依據。

1.材料與方法

1.1材料

云南切梢小蠹TyunOBP2基因序列來源于GenBank（登錄號：YN-2E01NAXM0001_B03.seq）。所用同源模建的結構與配體小分子的晶體數據都由分子繪圖GaussView軟件生成優化。

1.2方法

AutoDock是半柔性配體整體分子自動對接程序，允許小分子構象發生變化。進行配體取向及構象搜索時，采用模擬退火、遺傳算法來尋找最優結合取向和構象，用半經驗自由能計算方法來評價受體、配體之間的匹配情況。采用綠葉揮發性物質：（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇，（z）一3一己烯醇與模建氣味蛋白進行對接，討論其與受體的相互作用。

應用Autodocktool對蛋白質及小分子結構進行編輯，并轉換成pdbqt格式，應用Autodocktool進行剛性對接，將GridBox大小設置為60點×60點×60點，格點間距0.0375nm，即空間大小為2.25nm×2.25nm×2.25nm。將此晶格的中心位于預測得到的蛋白質活性中心附近，運用Lamarckian遺傳算法LGA，將能量搜索與遺傳算法相結合，以半經驗勢能函數作為自由能打分函數，對小分子構象及位置進行全局搜索，利用評分網格以及對接參數（Population為150，Maximun_num_evals設置為2500000）進行分子對接，并進行評分，計算小分子與生物大分子的結合強度（結合自由能）。應用均方根偏差（RMSD，表示預測構象對實際構象的偏差）對對接結果進行評價分析。

2.結果與分析

2.1結合自由能

在Autodock4進行循環搜尋對接構象后，以能量絕對值打分較高的前提下，選取均方根偏差較小的構象進行研究分析，從對接計算得到的聚類構象以及（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、（z）-3-己烯醇對接的結合能對比結果可以看出，3個受體中對接的殘基不同直接導致配體在受體中的構象不同（圖1），受體中的氧原子與（E）-2-己烯醇的羧基氫形成的氫鍵能量和表1中的相互作用勢能要低于另外2個小分子結合的勢能，表明氣味結合蛋白分子對（E）-2-己烯醇具有更高的親和力。

2.2結合模式

從圖2可以看出，云南切梢小蠹OBP活性位點位于蛋白質表面上的凹槽中，周圍分布OBP的重要功能殘基。在多種作用力的參與下，化合物（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、（z）一3一己烯醇牢固地結合在活性位點。從口袋結合模式看，與其他2個小分子相比，（E）-2-己烯醇較深入地進入了OBP的活性口袋，這是由于（E）-2-己烯醇較容易形成穩定的氫鍵，以利于其深入口袋（圖3、圖4）。

3.結論與討論

（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、（z）-3-己烯醇是非寄主植物闊葉樹的主要揮發性物質，是6個碳的綠葉揮發性物質。當這3種綠葉揮發性物質與寄主植物的氣味相混合時，會對小蠹蟲選擇產生干擾。本研究結果表明，（E）-2-己烯醇較其他2個小分子而言，更容易與云南切梢小蠹OBP結合，形成穩定的氫鍵。從化學結構來看，（E）-2-己烯醇中的糖取代基、羧基較多，更容易形成氫鍵；（E）-2-己烯醛、（z）-3-己烯醇中的羧基相對較少，形成的氫鍵較少，導致3種綠葉揮發性物質的結合能各不相同。王大偉等認為，48h后，經（E）-2-己烯醇處理后留在松梢外的云南切梢小蠹數量最多，（E）-2-己烯醇處理對云南切梢小蠹影響最大。本研究結果表明，（E）-2-己烯醇與BunOBP2結合能最低，更容易與r11yunOBP2結合，TyunOBP2與小分子物質的結合，可能通過占有該蛋白與寄主氣味結合的空間或者通過改變TyunOBP2三維結構，導致TyunOBP2難以識別寄主松樹散發的氣味。從對接的結合模式圖來看，小分子與受體分子表面的作用也是決定其活性的重要因素之一，（E）-2-己烯醇和OBP之間可能存在疏水作用力、范德華力，導致其結合能較低；因此，加強小分子的疏水性或者形成氫鍵能力均有可能增強化合物的抑制活性。本研究選用云南切梢小蠹1個已知的氣味結合蛋白作為對象，計算并模擬TyunOBP2與3個綠葉氣味物質的分子對接，計算結果與前人試驗結果一致，說明利用同源建模和分子對接方法模擬氣味物質與氣味結合蛋白結合有一定的可靠性。實際上，昆蟲在進化過程中發展多個氣味結合蛋白識別多種氣味物質，云南切梢小蠹也有多個氣味結合蛋白，是否還存在比TyunOBP2更容易與小分子綠葉氣味物質結合的其他氣味結合蛋白還需進一步研究。