云南玉溪煙區煙草蚜蟲對植物源農藥的敏感性及其解毒酶活力比較

達愛斯　溫麗娜　謝道燕　戴勛　田育天　夏玉珍　何成興　吳文偉　柴建萍　胡保文　王正旭　楊澤　羅雁婕　林莉

摘要：應用噴霧法測定了采自云南省玉溪市新平縣新化鄉和峨山縣岔河鄉的煙草蚜蟲種群對6種植物源殺蟲劑的毒力，并比較了2個煙蚜種群的3種主要解毒代謝酶活力、乙酰膽堿酯酶活力。結果表明，峨山縣岔河鄉煙蚜對植物源殺蟲劑的敏感性高于新平縣新化鄉的煙蚜，其中0.5%藜蘆堿可溶液劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑、1%苦皮藤素水乳劑、2%除蟲菊素水乳劑、除蟲菊浸膏對新平縣新化鄉和峨山縣岔河鄉煙蚜的毒力比分別為1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037；在高濃度處理下，6種植物源殺蟲劑對峨山縣岔河鄉、新平縣新化鄉煙蚜的室內盆栽藥效存在顯著性差異；0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿小劑在濃度不低于1125mL/hm²時，可有效防治峨山縣岔河鄉煙蚜，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑在濃度不低于2250mL/hm²時，可有效防治新平縣新化鄉煙蚜；2個地區煙蚜的谷胱甘肽s一轉移酶比活力有顯著差異，而羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶、乙酰膽堿酯酶的比活力差異不顯著。由結果可知，云南省玉溪市峨山縣岔河鄉和新平縣新化鄉煙蚜對6種植物源殺蟲劑的敏感性存在顯著差異，但羧酸酯酶、P450單加氧酶和乙酰膽堿酯酶3種解毒酶差異不顯著，研究結果可為使用植物源殺蟲劑防治煙蚜提供科學依據。

關鍵詞：煙蚜；植物源殺蟲劑；谷胱甘肽S-轉移酶；羧酸酯酶；細胞色素P450單加氧酶；乙酰膽堿酯酶

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0137-04

煙蚜（Myzus persicae）別稱桃蚜，屬同翅目蚜科瘤蚜屬，是一種重要的煙草害蟲，也是煙草病毒病的傳播介體。煙蚜以刺吸式口器吸收煙株葉、莖、花等部位的汁液，使被害煙株生長遲緩、葉片薄，嚴重時葉片向背面卷縮、變形，煙葉組織被破壞，而且煙蚜分泌蜜露污染煙葉，烘烤后的煙葉缺乏光澤，容易破碎，嚴重影響產量和品質。化學防治是防治煙蚜的主要措施之一，然而長期使用化學防治，致使煙蚜的抗藥性不斷增強及再猖獗發生，且使煙葉農藥殘留增加。因此，低毒、低殘留、不易產生抗藥性的植物源殺蟲劑日益受到了國內外的重視。

植物源殺蟲劑是植物與病蟲害的長期斗爭中產生的具有選擇性殺蟲、殺菌活性的一系列次生代謝物。植物源殺蟲劑具有選擇性，且對非靶標生物安全，能維護生態平衡，在自然界中更易降解而使其農藥殘留的危害降低，對自然環境產生的影響較小。玉溪市是云南省具有悠久歷史的煙葉重要產區，也是種植規模最大的地、州、市級煙區之一，對煙草病蟲害的防治極為重視。本研究為篩選適于防治煙蚜的植物殺蟲劑，并明確峨山縣岔河鄉和新平縣新化鄉煙蚜的抗藥性及其對不同植物源殺蟲劑的敏感性，比較了0.5%藜蘆堿可溶液劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、除蟲菊浸膏6種植物源殺蟲劑對玉溪市新平縣新化鄉和峨山縣岔河鄉煙蚜的室內毒力及其防治效果，并比較了2個煙區煙蚜解毒酶的比活力，以期對上述煙區使用植物源殺蟲劑防治煙蚜提供科學依據。

1.材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試蟲源新平縣新化鄉煙蚜種群采自云南省玉溪市新平縣新化鄉大寨常委會的煙株上，峨山縣岔河鄉煙蚜種群采白玉溪市峨山縣岔河鄉文山村委會的煙株上，這2個種群分別在室內利用盆栽煙苗進行飼養及擴繁。

1.1.2供試藥劑0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑均由成都新朝陽作物科學有限公司生產；0.3%苦參堿水劑由南通神雨綠色藥業有限公司生產；除蟲菊素浸膏（乙醇浸出液）由云南省農業科學院農業環境資源研究所提供。

1.1.3試驗試劑考馬斯亮藍（；250、細胞色素c、還原型谷胱甘肽，北京索萊寶科技有限公司生產；牛血清白蛋白，云科生物工程公司生產；3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），阿達瑪斯一貝塔公司生產；毒扁豆堿、堅固藍B鹽、1-氯-2，4-二硝基苯，西格瑪奧德里奇貿易有限公司生產；乙酸-α-萘酯，海源葉生物科技有限公司生產；碘化硫代乙酰膽堿，CROSORGANICS公司生產。

1.2試驗方法

1.2.1室內毒力測定方法以及盆栽藥效試驗室內毒力測定以及盆栽藥效試驗均采用噴霧法，在溫室內盆栽煙苗，待其生長到4～5張葉片接人煙蚜，讓其自然擴繁到一定數量后，進行室內毒力測定試驗；每個藥劑設置6個濃度，以清水為對照，每個處理設置3個重復，各個重復隨機排列，用小型噴霧器對煙蚜蟲進行葉面噴霧防治，每個處理的總噴霧量為150mL藥液。每株煙苗隨機標記3張展開葉，并調查煙蚜數量；施藥24h后調查煙蚜活蟲數，統計分析其室內毒力、防效。

1.2.2解毒酶比活力測定

1.2.2.1粗酶液制備及酶源蛋白質含量的測定選取50頭煙蚜，加0.05mol/L、pH值7.5的Tris-HCl緩沖液1mL，冰浴研漿，離心（4℃，12000r/min）20min，取上清作為工作酶液。蛋白含量測定采用Bradford的方法，用考馬斯亮藍染色，以牛血清蛋白為標準蛋白。

1.2.2.2谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）的測定

谷胱甘肽S-轉移酶對1-氯-2，4-二硝基苯的活性測定參照相關文獻并改進，每個處理樣品各設置3個重復。反應總體積為300mL，先分別加入100μL0.6mmol/LCDNB、100μL6mmol/L谷胱甘肽，混勻后在37℃條件下放置20min；然后加入100μ待測酶液（對照加入0.05mol/L、pH值7.5的Tris-HCl緩沖液）。利用酶標儀于37℃條件測定340nm下5min內吸光度D340nm的變化，每個樣品均設置3個重復。

1.2.2.3羧酸酯酶的測定

羧酸酯酶的活性測定參照并改進VanA@eren的方法，用α-萘酚制作標準曲線。每個處理樣品各設置3個重復。反應總體積為200mL，先分別加入10μL的0.3mmol/L底物、75μL酶液（對照加入0.04mol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液），混勻后在30℃條件下放置10min；然后加入顯色劑25μL，利用酶標儀于30℃條件測定600nm處的D600nm值，每個樣品均設置3個重復。根據制作的標準曲線和酶原蛋白含量的測定結果，將D600nm值換算成比活力。

1.2.2.4細胞色素P450單加氧酶的測定根據相關參考文獻報道的方法并進一步改進，以細胞色素c制作標準曲線。每個處理樣品各設置3個重復。反應總體積為325μL，先分別加入200μ的3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺、80μ磷酸鉀緩沖液（0.625mol/L，pH值7.2），然后加入20μL酶液（對照加入0.04mol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液），最后加入25μLH2O2，混勻后在室溫（25～27℃）放置2h。測定450nm處的D450bnm值，每個樣品均設置3個重復。根據制作的標準曲線和酶原蛋白含量的測定結果，將，D450nm值換算成比活力。

1.2.2.5

乙酰膽堿酯酶的測定參考Ellman等的方法并進一步改進。以碘代硫代乙酰膽堿（ATChI）為反應底物、5，5'-二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑。每個處理樣品各設置3個重復，反應總體積為300mL，先分別加入100μL10mmol/L的碘代硫代乙酰膽堿、100μL0.1mol/L磷酸緩沖液（pH值7.5）；再加入50μL酶液（對照加入0.1mol/L、pH值為7.5的PBS），混勻后在37℃條件下放置10min；再加入0.125mmol/L的DTNB，于37℃條件測定412nm處10min內的D412nm變化值，每個樣品均設置3個重復。

1.3數據統計與分析

上述所有試驗數據的統計及方差分析均采用SPSS軟件（sPSS17.0）進行，毒力回歸式由機率值分析法計算得到，并采用Duncan's新復極差法和獨立樣本t檢驗比較各處理間的差異性。

2.結果與分析

2.16種植物源殺蟲劑對煙蚜的室內毒力

采用噴霧法測定了6種植物源殺蟲劑對2個煙區煙蚜的室內毒力。結果表明，峨山縣岔河鄉煙蚜對藥劑敏感性高于新平縣新化鄉煙蚜對藥劑敏感性，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲菊浸膏對峨山縣岔河鄉煙蚜的半致死濃度（LC50）分別為2.356、6.632、5.640、2.592、1.642、15.053mg/L；6種藥劑對新平縣新化鄉煙蚜的半致死濃度LCso分別為4.288、509.615、11.927、2.736、3.115、482.249mh/L；6種藥劑對新平縣新化鄉煙蚜與峨山縣岔河鄉煙蚜的毒力比分別為1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037（表1）。峨山縣岔河鄉和新平縣新化鄉煙蚜對不同藥劑的敏感性存在差異，其中對2%除蟲菊素水乳劑、除蟲菊浸膏的敏感性差異較大，可能是新平縣新化鄉使用菊酯類殺蟲劑防治而使煙蚜產生耐藥性所造成的。

2.26種植物源殺蟲劑對2個煙區煙蚜的盆栽藥效試驗

比較了6種植物源殺蟲劑對峨山縣岔河鄉和新平縣新化鄉煙蚜藥后24h的盆栽藥效，防效結果見表2。由表2中結果可知，6種植物源殺蟲劑除了除蟲菊浸膏外，在4500mL²、2250mL/hm²的處理對峨山縣岔河鄉煙蚜的防治效果顯著高于對新平縣新化鄉煙蚜的防效（獨立樣本t檢驗，P<0.05）。在峨山縣岔河鄉，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑可有效防治煙蚜，其在相同濃度處理下的防效不存在顯著性差異（P<0.05，Duncan's新復極差測驗）；而對于新平縣新化鄉的煙蚜，僅有0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑的防效較高，4500mL/hm²濃度下其他部分藥劑的防效存在顯著差異。在2個煙區中，O.5%藜蘆堿可溶液劑相對于其他藥劑具有較好的防效，2.0%除蟲菊素水乳劑次之，1.0%苦皮藤素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲菊浸膏（乙醇浸出液）依次降低。此外，6種植物源殺蟲劑除了除蟲菊浸膏外，其在1125mL/hm²處理可有效防治峨山縣岔河鄉煙蚜，與高濃度處理無顯著差異；對于新平縣新化鄉，其藥劑濃度大于2250mL/hm²處理的防治才與其他處理存在顯著性差異。因此，峨山縣岔河鄉煙蚜對藥劑的敏感性明顯高于新平縣新化鄉煙蚜，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑在不低于1125mL/hm²的條件下可有效防治峨山縣岔河鄉煙蚜，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑在不低于2250mL/hmμ²的條件下可有效防治新平縣新化鄉煙蚜。

2.3峨山縣岔河鄉、新平縣新化鄉煙蚜解毒酶活力比較

采用生化法比較了峨山縣岔河鄉、新平縣新化鄉煙蚜的谷胱甘肽S-轉移酶、羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶、乙酰膽堿酯酶4種解毒酶的比活力，結果見表3。可以看出，岔河鄉、新化鄉煙蚜的谷胱甘肽S-轉移酶的比活力分別為0.7644、2.0724mmol/（μg·min）；羧酸酯酶的比活力分別為4.8230、6.4444mmol/（μg·min）；細胞色素P450單加氧酶的比活力分別為2.3563、4.0482EU/（μg·min）；乙酰膽堿酯酶的比活力分別為0.0166、0.0136mmol/（min·mg）。峨山縣岔河鄉與新平縣新化鄉煙蚜的谷胱甘肽S-轉移酶、羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶、乙酰膽堿酯酶的活力比分別為2.7111、1.3362、1.7180、0.8193。因此，新平縣新化鄉煙蚜除乙酰膽堿酯酶外其他3種解毒酶比活力均高于峨山縣岔河鄉煙蚜，但2個地區煙蚜除谷胱甘肽S-轉移酶比活力間差異顯著，其他3種解毒酶比活力無顯著性差異（獨立樣本t檢驗）。

3.結論與討論

本研究應用噴霧法比較了分別采自云南省玉溪市峨山縣岔河鄉和新平縣新化鄉的煙蚜種群對6種植物源殺蟲劑的毒力和室內防治效果，并比較了2個煙蚜種群的3種解毒酶和1個靶標酶的比活力。結果表明，0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲菊浸膏對新平縣新化鄉煙蚜與峨山縣岔河鄉煙蚜的毒力比分別1.820、76.842、2.115、1.056、1.897、32.037，即新平縣新化鄉煙蚜對6種藥劑的敏感性低于對峨山縣岔河鄉煙蚜，其室內毒力高于峨山縣岔河鄉煙蚜毒力；而在高濃度處理下，室內防效顯著低于峨山縣岔河鄉煙蚜。新平縣新化鄉煙蚜的谷胱甘肽S-轉移酶、羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶的比活力均高于峨山縣岔河鄉煙蚜，但羧酸酯酶、細胞色素P450單加氧酶的比活力不存在顯著性差異，這可能是峨山縣岔河鄉、新平縣新化鄉煙蚜對藥劑的耐藥性差異不顯著所致。

新平縣新化鄉一直以來主要采用常規化學防治，使得當地的煙蚜種群對防控藥劑敏感性下降，室內防控效果下降，解毒酶比活力增加。而峨山縣岔河鄉的田間煙蚜的施藥時間較短且次數較少，對藥劑比較敏感。6種植物源殺蟲劑中，新平縣新化鄉煙蚜對2.0%除蟲菊素水乳劑和擬除蟲菊膏的敏感性最低。0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑在不低于1125mL/hm²可有效防治峨山縣岔河鄉煙蚜，其在相同濃度處理下的防效不存在顯著性差異。0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑在不低于2250mL/hm²的條件下對新平縣新化鄉煙蚜的防效較高，與其他藥劑存在顯著性差異。

綜上所述，云南省玉溪市峨山縣岔河鄉和新平縣新化鄉煙蚜對0.5%藜蘆堿可溶液劑、2%除蟲菊素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、0.3%苦參堿水劑、除蟲菊浸膏6種植物源殺蟲劑的敏感性存在不同的差異，除谷胱甘肽S-轉移酶的比活力差異顯著外，其他3種解毒酶的比活力均無顯著差異。0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑、1.0%苦皮藤素水乳劑、1.5%苦參堿可溶液劑、0.3%苦參堿水劑在不低于1125mL/hm2的條件下可有效防治峨山縣岔河鄉煙蚜；0.5%藜蘆堿可溶液劑、2.0%除蟲菊素水乳劑在不低于2250mL/hm²的條件下可有效防治新平縣新化鄉煙蚜。本研究結果可為在煙草上使用植物源殺蟲劑防治煙蚜提供科學依據。