應(yīng)用免疫冷凍超薄切片技術(shù)觀察羅非魚腸道M樣細(xì)胞

李莉萍等

摘要：為鑒定羅非魚腸道M樣細(xì)胞及各腸道分布情況，利用FITC標(biāo)記的荊豆凝集素（UEA-1）對羅非魚前、中、后腸冰凍切片進(jìn)行直接免疫熒光顯微觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在羅非魚前、中、后腸均觀察到M樣細(xì)胞；中腸和后腸M樣細(xì)胞數(shù)量比前腸明顯多。免疫組M樣細(xì)胞數(shù)量顯著比空白對照組多，且免疫組前腸數(shù)量明顯多于空白對照組前腸。研究表明，在羅非魚前、中、后腸存在M樣細(xì)胞，腸道接觸無乳鏈球菌弱毒抗原之后，在數(shù)量、分布上均發(fā)生變化，初步表明M樣細(xì)胞參與腸道免疫應(yīng)答。

關(guān)鍵詞：羅非魚；M細(xì)胞；荊豆凝集素

中圖分類號： S917；S942.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0264-03

通信作者：陳明，博士，副研究員，主要從事水產(chǎn)疫苗與免疫技術(shù)研究。E-mail：cm990919@163.com。近年來，鏈球菌病對我國羅非魚養(yǎng)殖危害日趨嚴(yán)重，藥物治療不能有效控制該病，反而易產(chǎn)生耐藥性，污染環(huán)境，同時還存在食品安全隱患[1]。而疫苗預(yù)防是控制該病最有效方法之一。其中注射疫苗免疫效果好，保護(hù)期長，但操作麻煩，在實(shí)際生產(chǎn)中難以大面積推廣應(yīng)用[2]。口服疫苗操作方便、對魚體傷害小，適合大規(guī)模魚集體免疫，但其免疫保護(hù)率低，保護(hù)期短[3]，其原因之一可能是羅非魚腸道黏膜細(xì)胞攝取、吸收和呈遞抗原有限。因此，有必要對魚類腸道黏膜抗原遞呈進(jìn)行研究。

在腸道黏膜上皮內(nèi)有一種特殊類型的M樣細(xì)胞，也叫微皺褶細(xì)胞（microfold cell）[4-5]，它是腸道免疫組織吸收微生物或抗原的主效應(yīng)細(xì)胞，是激發(fā)腸道局部免疫反應(yīng)首要門戶。目前普遍認(rèn)為，M樣細(xì)胞能有效地?cái)z取和轉(zhuǎn)運(yùn)腸腔內(nèi)各種大分子和抗原至上皮下集合淋巴結(jié)的免疫細(xì)胞，并將抗原進(jìn)一步加工和提呈，從而激活特異性B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。而近年來有關(guān)腸道免疫反應(yīng)研究表明，絕大部分口服疫苗都需經(jīng)由M樣細(xì)胞吸收，它是許多細(xì)菌和病毒致病以及黏膜疫苗作用關(guān)鍵[6]，其攝取效率決定疫苗免疫效果。目前在人、雞、兔、鼠、豬、牛、猴、犬等動物與淋巴組織相關(guān)聯(lián)的表面上皮中均發(fā)現(xiàn)有M樣細(xì)胞存在[7-8]。在魚類只見虹鱒報(bào)道有M樣細(xì)胞[9]，其他未見報(bào)道。

本試驗(yàn)利用FITC標(biāo)記荊豆凝集素（UEA-1）對羅非魚前、中、后腸道冰凍切片進(jìn)行直接免疫熒光染色顯微觀察，尋找羅非魚腸道內(nèi)形態(tài)上類似于哺乳動物的M樣細(xì)胞及分布情況，為下一步研究羅非魚腸道M樣細(xì)胞攝取和呈遞抗原作用機(jī)理及無乳鏈球菌口服疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)魚試驗(yàn)魚來自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院羅非魚良種場的吉富羅非魚，平均體質(zhì)量250～300 g，分成2組，每組20尾，暫養(yǎng)于600 L大缸桶中，24 h充氧，在28±5 ℃條件下飼養(yǎng)2周，使之適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境。每3 d換水2/3。每天飼喂2次（09：00和16：00），日投喂量占魚體質(zhì)量的2%。

1.1.2試驗(yàn)試劑Lectin from ulex europaeus（FITC conjugate）購自Sigma公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；血平板河南購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司；TSB培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司；無乳鏈球菌弱毒菌株YM001為本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得；其他生物、化學(xué)試劑均為從商業(yè)公司購買的分析純產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1疫苗制備從-80 ℃冰箱中取出無乳鏈球菌弱毒菌株YM001在血平板上劃線復(fù)蘇，24 h后轉(zhuǎn)到TSB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。取120 mL菌液10 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS定容至20 mL，用噴壺均勻噴至120 mL飼料。晾干 5 min，投喂免疫組；空白對照組用不添加弱毒株飼料飼喂。飼喂3 h后采樣。

1.2.2取樣先取空白對照組魚腸道，然后再取免疫組魚腸道。將活魚剖腹后，迅速取腸的前、中、后段，約4 cm左右。前段在胃后端至腸的第1個彎曲之間的中間取樣；中段在腸的第1個彎曲至最后1個彎曲的中間取樣；后段在最后1個彎曲至肛門的中間取樣[10]。

1.2.3冰凍切片制備樣品用PBS沖洗3次，濾紙吸干；迅速置于4 ℃預(yù)冷4%多聚甲醛溶液中1 h。用含10% FBS細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗3次，濾紙吸干；立即放在液氮中進(jìn)行冷凍1 h以上。取樣品修成0.3 cm×0.3 cm，厚度0.3 cm小塊，用OCT在金屬錫箔盒內(nèi)進(jìn)行包埋，把包埋組織置于冰凍切片機(jī)內(nèi)，Leica CM3050冰凍切片機(jī)橫切，厚為5 μm，用防脫落載玻片粘片，置于4 ℃保存。

1.2.4免疫熒光染色與觀察將冰凍切片置于37 ℃的FITC-UEA-1溶液（1 ∶80）避光作用1 h后，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加少量50%的PBS甘油溶液封片，置于熒光顯微鏡下檢測，腸道上皮組織內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光的判定為M樣細(xì)胞。

2結(jié)果與分析

由圖1可知，在免疫組與空白對照組羅非魚前、中、后腸均觀察到M樣細(xì)胞；從數(shù)量上看，不管是免疫組，還是空白對照組，中腸和后腸M樣細(xì)胞比較多，前腸比較少；并且M樣細(xì)胞主要集中在中腸和后腸。免疫之后，M樣細(xì)胞數(shù)量明顯比空白對照組多，并且前腸數(shù)量明顯多于空白對照組。

3討論

抗原成功黏附并被 M 樣細(xì)胞吸收是其誘發(fā)黏膜免疫反應(yīng)關(guān)鍵，這種作用主要依賴于細(xì)菌表面凝集素與M樣細(xì)胞表面表達(dá)的糖基相互作用。M樣細(xì)胞膜表面覆蓋著糖蛋白中的巖藻糖，可以被荊豆凝集素（UEA-1）特異性識別并結(jié)合[11-12]，因此有人提出UEA-1可以作為鑒定M樣細(xì)胞特異指標(biāo)[13-15]。陳潔等分別利用FITC和膠體金顆粒（10 nm） 標(biāo)記的UEA-1對正常小鼠小腸Peyers集合淋巴小結(jié)濾泡相關(guān)上皮中M樣細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，通過熒光顯微鏡和免疫透射電鏡觀察，證明UEA-1可特異性地識別M樣細(xì)胞[16]。以前的報(bào)道稱在硬骨魚類上沒有M樣細(xì)胞，但最近研究發(fā)現(xiàn)在鮭魚中腸的第2腸段部分存在與哺乳動物M細(xì)胞相似的M樣細(xì)胞。Fuglem等應(yīng)用FITC標(biāo)記的UEA-1和rho-damine標(biāo)記的WGA分別對虹鱒中腸的第2腸段細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅UEA陽性細(xì)胞具有哺乳動物M樣細(xì)胞特征[9]。本研究也采用FITC結(jié)合UEA-1特異方法檢測M樣細(xì)胞，成功從羅非魚腸道中觀察到M樣細(xì)胞，該結(jié)果有力地證明羅非魚前、中、后腸道中存在M樣細(xì)胞。試驗(yàn)整個過程只需4 h，相對于采用電鏡、膠體金等方法鑒定組織中細(xì)胞，具有操作快，步驟簡單，組織抗原保存良好，敏感度高、特異性強(qiáng)，結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)[17]。

魚類腸道上皮沒有類似哺乳動物Peyer氏淋巴集結(jié)，但是有著相當(dāng)多的淋巴細(xì)胞，研究表明魚類淋巴細(xì)胞主要分布在腸道中后部[18]。陳潔等用傷寒減毒活疫苗Ty21a免疫小鼠后觀察發(fā)現(xiàn)該疫苗可誘導(dǎo)M樣細(xì)胞數(shù)量增加[19]。徐佳用免疫熒光方法檢測口服Ag85A DNA疫苗在小鼠腸道M細(xì)胞表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ag85A DNA疫苗在小鼠腸道局部M細(xì)胞有表達(dá)，并且該DNA疫苗可以被腸道M細(xì)胞攝取[20]。黃玉章等研究黃芪多糖對羅非魚腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸道免疫細(xì)胞的影響時發(fā)現(xiàn)，同一組不同腸段上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量中腸最多，后腸次之，前腸最少[21]。此外，在同一組的不同腸段中，羅非魚腸道內(nèi)黏液細(xì)胞的數(shù)量順序?yàn)橹心c>后腸>前腸。在大西洋鮭中，普遍認(rèn)為前腸主要執(zhí)行消化功能，而后腸才是主要抗原攝取以及免疫應(yīng)答部位[22]。在舌齒鱸腸道中，越是靠近肛門，淋巴細(xì)胞數(shù)量就越多，表明其后腸具有更高免疫相關(guān)性[23]。Companjen等也證實(shí)了魚類后腸為抗原的主要吸收和加工部位，抗原可在后腸被巨噬細(xì)胞吞噬，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答[24]。本研究采用無乳鏈球菌弱毒株拌料投喂羅非魚，發(fā)現(xiàn)其腸道在接觸抗原之后，M樣細(xì)胞在數(shù)量、分布上均發(fā)生了明顯變化，免疫組M樣細(xì)胞數(shù)量比空白對照組增多，并且免疫組前腸數(shù)量明顯多于空白對照組前腸，初步表明M樣細(xì)胞參與免疫應(yīng)答過程，但目前誘導(dǎo)M樣細(xì)胞數(shù)量升高的機(jī)制尚不清楚，還有待于進(jìn)一步探索。從分布上看，無論是免疫組還是空白對照組，M樣細(xì)胞主要分布在中腸和后腸，推測羅非魚前腸主要對外來物質(zhì)進(jìn)行初步識別消化，中后腸主要對抗原進(jìn)行攝取及產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，本試驗(yàn)結(jié)果為深入研究羅非魚腸道免疫機(jī)理及口服疫苗開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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