應用免疫冷凍超薄切片技術觀察羅非魚腸道M樣細胞

李莉萍等

摘要：為鑒定羅非魚腸道M樣細胞及各腸道分布情況，利用FITC標記的荊豆凝集素（UEA-1）對羅非魚前、中、后腸冰凍切片進行直接免疫熒光顯微觀察。結果發現，在羅非魚前、中、后腸均觀察到M樣細胞；中腸和后腸M樣細胞數量比前腸明顯多。免疫組M樣細胞數量顯著比空白對照組多，且免疫組前腸數量明顯多于空白對照組前腸。研究表明，在羅非魚前、中、后腸存在M樣細胞，腸道接觸無乳鏈球菌弱毒抗原之后，在數量、分布上均發生變化，初步表明M樣細胞參與腸道免疫應答。

關鍵詞：羅非魚；M細胞；荊豆凝集素

中圖分類號： S917；S942.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0264-03

通信作者：陳明，博士，副研究員，主要從事水產疫苗與免疫技術研究。E-mail：cm990919@163.com。近年來，鏈球菌病對我國羅非魚養殖危害日趨嚴重，藥物治療不能有效控制該病，反而易產生耐藥性，污染環境，同時還存在食品安全隱患[1]。而疫苗預防是控制該病最有效方法之一。其中注射疫苗免疫效果好，保護期長，但操作麻煩，在實際生產中難以大面積推廣應用[2]。口服疫苗操作方便、對魚體傷害小，適合大規模魚集體免疫，但其免疫保護率低，保護期短[3]，其原因之一可能是羅非魚腸道黏膜細胞攝取、吸收和呈遞抗原有限。因此，有必要對魚類腸道黏膜抗原遞呈進行研究。

在腸道黏膜上皮內有一種特殊類型的M樣細胞，也叫微皺褶細胞（microfold cell）[4-5]，它是腸道免疫組織吸收微生物或抗原的主效應細胞，是激發腸道局部免疫反應首要門戶。目前普遍認為，M樣細胞能有效地攝取和轉運腸腔內各種大分子和抗原至上皮下集合淋巴結的免疫細胞，并將抗原進一步加工和提呈，從而激活特異性B淋巴細胞和T淋巴細胞。而近年來有關腸道免疫反應研究表明，絕大部分口服疫苗都需經由M樣細胞吸收，它是許多細菌和病毒致病以及黏膜疫苗作用關鍵[6]，其攝取效率決定疫苗免疫效果。目前在人、雞、兔、鼠、豬、牛、猴、犬等動物與淋巴組織相關聯的表面上皮中均發現有M樣細胞存在[7-8]。在魚類只見虹鱒報道有M樣細胞[9]，其他未見報道。

本試驗利用FITC標記荊豆凝集素（UEA-1）對羅非魚前、中、后腸道冰凍切片進行直接免疫熒光染色顯微觀察，尋找羅非魚腸道內形態上類似于哺乳動物的M樣細胞及分布情況，為下一步研究羅非魚腸道M樣細胞攝取和呈遞抗原作用機理及無乳鏈球菌口服疫苗研發提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗魚試驗魚來自廣西水產科學研究院羅非魚良種場的吉富羅非魚，平均體質量250～300 g，分成2組，每組20尾，暫養于600 L大缸桶中，24 h充氧，在28±5 ℃條件下飼養2周，使之適應飼養環境。每3 d換水2/3。每天飼喂2次（09：00和16：00），日投喂量占魚體質量的2%。

1.1.2試驗試劑Lectin from ulex europaeus（FITC conjugate）購自Sigma公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM培養基購自Gibco公司；血平板河南購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司；TSB培養基購自杭州微生物試劑有限公司；無乳鏈球菌弱毒菌株YM001為本實驗室篩選獲得；其他生物、化學試劑均為從商業公司購買的分析純產品。

1.2實驗方法

1.2.1疫苗制備從-80 ℃冰箱中取出無乳鏈球菌弱毒菌株YM001在血平板上劃線復蘇，24 h后轉到TSB培養基中擴大培養。取120 mL菌液10 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS定容至20 mL，用噴壺均勻噴至120 mL飼料。晾干 5 min，投喂免疫組；空白對照組用不添加弱毒株飼料飼喂。飼喂3 h后采樣。

1.2.2取樣先取空白對照組魚腸道，然后再取免疫組魚腸道。將活魚剖腹后，迅速取腸的前、中、后段，約4 cm左右。前段在胃后端至腸的第1個彎曲之間的中間取樣；中段在腸的第1個彎曲至最后1個彎曲的中間取樣；后段在最后1個彎曲至肛門的中間取樣[10]。

1.2.3冰凍切片制備樣品用PBS沖洗3次，濾紙吸干；迅速置于4 ℃預冷4%多聚甲醛溶液中1 h。用含10% FBS細胞培養液沖洗3次，濾紙吸干；立即放在液氮中進行冷凍1 h以上。取樣品修成0.3 cm×0.3 cm，厚度0.3 cm小塊，用OCT在金屬錫箔盒內進行包埋，把包埋組織置于冰凍切片機內，Leica CM3050冰凍切片機橫切，厚為5 μm，用防脫落載玻片粘片，置于4 ℃保存。

1.2.4免疫熒光染色與觀察將冰凍切片置于37 ℃的FITC-UEA-1溶液（1 ∶80）避光作用1 h后，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加少量50%的PBS甘油溶液封片，置于熒光顯微鏡下檢測，腸道上皮組織內出現綠色熒光的判定為M樣細胞。

2結果與分析

由圖1可知，在免疫組與空白對照組羅非魚前、中、后腸均觀察到M樣細胞；從數量上看，不管是免疫組，還是空白對照組，中腸和后腸M樣細胞比較多，前腸比較少；并且M樣細胞主要集中在中腸和后腸。免疫之后，M樣細胞數量明顯比空白對照組多，并且前腸數量明顯多于空白對照組。

3討論

抗原成功黏附并被 M 樣細胞吸收是其誘發黏膜免疫反應關鍵，這種作用主要依賴于細菌表面凝集素與M樣細胞表面表達的糖基相互作用。M樣細胞膜表面覆蓋著糖蛋白中的巖藻糖，可以被荊豆凝集素（UEA-1）特異性識別并結合[11-12]，因此有人提出UEA-1可以作為鑒定M樣細胞特異指標[13-15]。陳潔等分別利用FITC和膠體金顆粒（10 nm） 標記的UEA-1對正常小鼠小腸Peyers集合淋巴小結濾泡相關上皮中M樣細胞形態結構進行觀察，通過熒光顯微鏡和免疫透射電鏡觀察，證明UEA-1可特異性地識別M樣細胞[16]。以前的報道稱在硬骨魚類上沒有M樣細胞，但最近研究發現在鮭魚中腸的第2腸段部分存在與哺乳動物M細胞相似的M樣細胞。Fuglem等應用FITC標記的UEA-1和rho-damine標記的WGA分別對虹鱒中腸的第2腸段細胞進行觀察，結果發現僅UEA陽性細胞具有哺乳動物M樣細胞特征[9]。本研究也采用FITC結合UEA-1特異方法檢測M樣細胞，成功從羅非魚腸道中觀察到M樣細胞，該結果有力地證明羅非魚前、中、后腸道中存在M樣細胞。試驗整個過程只需4 h，相對于采用電鏡、膠體金等方法鑒定組織中細胞，具有操作快，步驟簡單，組織抗原保存良好，敏感度高、特異性強，結果可靠等優點[17]。

魚類腸道上皮沒有類似哺乳動物Peyer氏淋巴集結，但是有著相當多的淋巴細胞，研究表明魚類淋巴細胞主要分布在腸道中后部[18]。陳潔等用傷寒減毒活疫苗Ty21a免疫小鼠后觀察發現該疫苗可誘導M樣細胞數量增加[19]。徐佳用免疫熒光方法檢測口服Ag85A DNA疫苗在小鼠腸道M細胞表達，發現Ag85A DNA疫苗在小鼠腸道局部M細胞有表達，并且該DNA疫苗可以被腸道M細胞攝取[20]。黃玉章等研究黃芪多糖對羅非魚腸絨毛形態結構及腸道免疫細胞的影響時發現，同一組不同腸段上皮內淋巴細胞數量中腸最多，后腸次之，前腸最少[21]。此外，在同一組的不同腸段中，羅非魚腸道內黏液細胞的數量順序為中腸>后腸>前腸。在大西洋鮭中，普遍認為前腸主要執行消化功能，而后腸才是主要抗原攝取以及免疫應答部位[22]。在舌齒鱸腸道中，越是靠近肛門，淋巴細胞數量就越多，表明其后腸具有更高免疫相關性[23]。Companjen等也證實了魚類后腸為抗原的主要吸收和加工部位，抗原可在后腸被巨噬細胞吞噬，誘導產生免疫應答[24]。本研究采用無乳鏈球菌弱毒株拌料投喂羅非魚，發現其腸道在接觸抗原之后，M樣細胞在數量、分布上均發生了明顯變化，免疫組M樣細胞數量比空白對照組增多，并且免疫組前腸數量明顯多于空白對照組前腸，初步表明M樣細胞參與免疫應答過程，但目前誘導M樣細胞數量升高的機制尚不清楚，還有待于進一步探索。從分布上看，無論是免疫組還是空白對照組，M樣細胞主要分布在中腸和后腸，推測羅非魚前腸主要對外來物質進行初步識別消化，中后腸主要對抗原進行攝取及產生免疫應答。因此，本試驗結果為深入研究羅非魚腸道免疫機理及口服疫苗開發提供理論基礎。

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