低溫處理下白玉菇絲氨酸蛋白酶的活性及分子特征

孫新菊等

摘要：白玉菇（Hypsizygus marmoreus）是真姬菇的白色品種，其營養價值豐富，具有獨特的蟹香味。為延長白玉菇的貨架期，對其進行低溫處理，并研究在貯藏過程中絲氨酸蛋白酶活性及分子特征的變化。研究結果顯示，白玉菇在低溫（4 ℃）處理下可保鮮5 d，而在常溫（25～28 ℃）下保鮮時間則很短（1～2 d）；對白玉菇貯藏過程中絲氨酸蛋白酶的活性及Spr基因表達的研究表明：低溫處理下絲氨酸蛋白酶的活性及基因的表達都明顯低于對照。研究結果說明，白玉菇的貨架期與絲氨酸蛋白酶活性密切相關。

關鍵詞：白玉菇；低溫處理；絲氨酸蛋白酶；Spr基因表達；分子特征

中圖分類號： S646.909+.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0270-03

白玉菇味比平菇鮮，肉比滑菇厚，質比香菇韌，口感極佳，還具有獨特的蟹香味。白玉菇的蛋白質中氨基酸種類齊全，包括8種人體必需氨基酸，其菇體潔白如玉，質地細膩，是一種低熱量、低脂肪的保健食品[1]。

在食用菌貯藏過程中，會受到溫度、水分、采收時期、氣體環境、病原菌感染及有氧呼吸等的影響而出現失重、菌柄生長、菌傘開張、菌褶發育、菌蓋伸展、孢子形成與彈射、纖維素化、組織呈水浸狀、褐變以及品質下降等現象[2]，這些癥狀的產生與食用菌的生理代謝及其分子機理密切相關。食用菌儲藏過程中，蛋白質的降解會引起細胞結構及生理功能的變化，還會引起氨基酸含量的升高，正是氨基酸含量及組成的變化造成了食用菌風味的變化[3]。絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要蛋白水解酶，廣泛分布于植物中，在生物有機體中起著重要而廣泛的生理作用[4-5]。目前已經從芫荽、歐芹、雙孢菇等植物中分離到了不同類型的絲氨酸蛋白酶，其活性隨著植物生長發育階段的不同而變化。Azeez等研究發現，在唐菖蒲的衰老過程中絲氨酸蛋白酶的活性不斷提高[6]；Roberts等采用蛋白酶單一抑制劑的檢測方法在衰老的大麥葉片中和暗誘導衰老的大麥葉片中發現2種絲氨酸蛋白酶[7]。多種植物的衰老過程都與絲氨酸蛋白酶活性的不斷提高相關，如大麥、鳶尾、歐芹、月季、木樨和雙孢菇等[4-11]。

為延長白玉菇的貨架期，本研究對其進行低溫處理，并研究在貯藏過程中絲氨酸蛋白酶活性及分子特征的變化。通過對白玉菇絲氨酸蛋白酶活性的測定及Spr基因表達的研究，不僅有助于揭示白玉菇采后品質變化的分子機制，并可為調控白玉菇采后保鮮提供新途徑。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料來自當地超市剛剛上架的白玉菇，并在1 h內拿到實驗室，選擇沒有機械損傷、疾病以及形狀、顏色均勻的作為試驗材料（圖1-a）。試驗材料分為2組，每組10個，一組放在4 ℃冰箱，另一組常溫放置（25～28 ℃）；分別放置 5 d，每組3次重復。每組的3個重復每天分別取樣（菌柄、菌蓋、菌褶）后立即用液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.2試驗方法

1.2.1絲氨酸蛋白酶活性的測定白玉菇絲氨酸蛋白酶活性的測定具體步驟參照絲氨酸蛋白酶（PRSS）ELISA試劑盒說明。

1.2.2基因組DNA提取采用改良的CTAB-氯仿-異戊醇法進行白玉菇基因組DNA提取[12]。

1.2.3總RNA的提取及cDNA的合成本試驗提取RNA所用的離心管、槍頭等塑料用品先用0.1%的DEPC水浸泡12 h，再高壓蒸汽滅菌20 min（120～126 ℃），烘干。研缽、研棒用三氯甲烷浸泡2 h，用干凈手套裝好并放入80 ℃烘箱中2 h，烘干。具體步驟參照BioFlux RNA提取試劑盒說明。

取1 μL RNA，加入2 μL溴酚藍，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果出現28S、18S 2條帶，說明RNA完整，5S帶有時也會出現。28S帶的濃度是18S帶的2倍，說明RNA質量很好（圖2）。第1鏈cDNA合成的具體步驟參照TaKaRa提取試劑盒說明。

1.2.4實時熒光定量PCR（qRT-PCR）用DNASTAR軟件設計特異引物ActinF、ActinR、SprF、SprR（表1）。PCR反應體系（25 μL）參照TaKaRa RT-PCR反應體系說明書。在Bio-Rad熒光定量PCR儀上進行實時定量PCR，PCR反應程

序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。每個樣品3次重復，Actin基因為表達分析內標參照，使用2-ΔΔCT法計算待測基因相對表達量，用Excel 2003整理試驗數據并作圖。

表1特異引物名稱及信息

引物堿基序列（5′→3′）ActinFTACTCCGTCTGGATTGGTGActinRGACTCGTCGTATTCTTGCTTSprFGCAAGCGCAGATGGAAATGGACASprRCTGGCGCCGACCGTGATGACT

2結果與分析

2.1白玉菇貨架期

白玉菇在低溫（4 ℃）處理下可保鮮5 d；在常溫（25～28 ℃）下保鮮時間則很短，為1～2 d（圖1-c），之后出現菌傘開張、組織失水、褐變及營養物質流失等現象。

2.2絲氨酸蛋白酶的活性

由圖3可知，白玉菇在常溫貯藏過程中，絲氨酸蛋白酶的活性與貯藏0 d相比，一直處于上升趨勢并在貯藏4 d升到最高，之后又下降；在低溫貯藏過程中，絲氨酸蛋白酶的活性一直處于下降趨勢，直到在貯藏5 d時降到最低點。另外，在整個貯藏過程中，常溫處理下白玉菇絲氨酸蛋白酶的活性明顯高于低溫處理，可見低溫處理可以抑制絲氨酸蛋白酶的活性。

2.3絲氨酸蛋白酶基因的表達

應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析表明，絲氨酸蛋白酶基因在貯藏0 d的白玉菇菌柄中的表達量最大，其次是菌蓋，菌褶中的表達量最低（圖4）。絲氨酸蛋白酶基因在常溫貯藏5 d的白玉菇菌柄中的表達量最大，在菌蓋、菌褶中的表達量很低；在低溫貯藏5 d的白玉菇菌柄中有少量表達，在菌蓋、菌褶中不表達（圖5）。絲氨酸蛋白酶基因在常溫貯藏的白玉菇菌柄中的表達一直處于上升趨勢并在貯藏4 d時升到最高，之后又下降；而在低溫貯藏的白玉菇菌柄中一直處于下降趨勢；絲氨酸蛋白酶基因在常溫貯藏的白玉菇菌柄中的表達量明顯高于低溫貯藏的（圖6）。總體看出，低溫處理下，絲氨酸蛋白酶基因的表達受到抑制，這個結果與絲氨酸蛋白酶的活性變化相一致。

3討論

由于食用菌貯藏過程中極易變質，薄膜氣調包裝[13]、化學處理方法[14]、輻照處理[15]、溫度處理及CO2氣調處理[16]等采后處理技術已被廣泛用于各種食用菌，以解決其采后腐爛、貨架期短及品質劣變的問題。蛋白酶在植物細胞程序性死亡（PCD）及衰老過程中均起重要作用[17-19]，白玉菇采收后，蛋白質會因為蛋白酶或肽酶的作用分解成氨基酸而降解，在一定程度上導致菇體衰老、品質及商品性急劇下降，因此研究白玉菇采后安全、有效的保鮮技術顯得尤為重要。

絲氨酸蛋白酶廣泛分布于植物中，多種植物的衰老過程都與其活性的不斷提高相關聯[4-10]。絲氨酸蛋白酶不僅作用于蛋白質的降解，還常常作為一種信號涉及細胞程序性死亡（PCD）或調控細胞自噬[6，20-23]。在貯藏0、1 d的雙孢菇菌柄中，絲氨酸蛋白酶的活性比較低；而從貯藏2 d開始，其活性快速升高直到貯藏4 d，到貯藏5 d又下降[10]。在本研究中，白玉菇在常溫貯藏過程中，絲氨酸蛋白酶活性的變化與Burton等研究雙孢菇的結論[10]基本一致；本研究討論在低溫貯藏過程中，絲氨酸蛋白酶的活性一直處于下降趨勢，并且在整個貯藏過程中，低溫處理下白玉菇絲氨酸蛋白酶的活性明顯低于常溫處理，低溫能夠抑制絲氨酸蛋白酶的活性，從而延長貨架期。

Kingsnorth等研究發現，絲氨酸蛋白酶基因在剛采收的雙孢菇中不表達，而在采后貯藏1 d的雙孢菇中開始表達，并在第3天達到最大值，之后又下降；Kingsnorth等還對雙孢菇不同組織中絲氨酸蛋白酶基因的表達進行研究，發現在貯藏2 d的雙孢菇菌柄中的表達量最大[24]。Heneghan等應用綠色熒光蛋白和雙孢菇Spr1基因啟動子技術對該基因在雙孢菇中的表達進行了研究，發現在雙孢菇子實體中，Spr1基因活動定位于采后衰老的子實體菌柄中[11]。本研究中，在白玉菇3個不同部位（菌柄、菌蓋、菌褶），絲氨酸蛋白酶基因在菌柄中的表達量最大；與低溫處理相比較，絲氨酸蛋白酶在常溫貯藏4 d的白玉菇菌柄中的表達量最大，這些結果與Heneghan等的研究結果[11，24]基本一致。從本研究結果可以看出，低溫處理下，絲氨酸蛋白酶的活性和基因的表達均受到抑制，表明絲氨酸蛋白酶的高活性及高表達量在一定程度上導致白玉菇的衰老、品質及商品性急劇下降。本研究有助于闡明白玉菇衰老的分子機制，并可為調控白玉菇采后保鮮以及延長貨架期提供重要的理論與實踐意義。

參考文獻：

[1]李挺，宋斌，林群英，等. 白玉菇的研究進展[J]. 貴州科學，2011，29（2）：48-52.

[2]Braaksma A，Schaap D J，De Vrije T，et al. Ageing of the mushroom （Agaricus bisporus） under post-harvest conditions[J]. Postharvest Biology and Technology，1994，4（1/2）：99-110.

[3]秦俊哲，呂嘉櫪. 食用菌貯藏保鮮與加工新技術[M]. 北京：化學工業出版社，2003：51-55.

[4]趙喜亭，叢日晨，劉曉靜，等. 失水脅迫對月季花瓣內肽酶活性的誘導及對花朵衰老進程的影響[J]. 中國農業科學，2008，41（2）：516-524.

[5]陽韶昆，蔡璇，鄒晶晶，等. 桂花開放與衰老過程中花瓣蛋白酶活性與種類的變化[J]. 園藝學報，2012，39（10）：1967-1974.

[6]Azeez A，Sane A P，Bhatnagar D，et al. Enhanced expression of serine proteases during floral senescence in Gladiolus[J]. Phytochemistry，2007，68（10）：1352-1357.

[7]Roberts I N，Passeron S，Barneix A J. The two main endoproteases present in dark-induced senescent wheat leaves are distinct subtilisin-like proteases[J]. Planta，2006，224（6）：1437-1447.

[8]Anto C M，Malcata F X. Plant serine proteases：biochemical，physiological and molecular features[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2005，43（7）：637-650.

[9]Arora A，Singh V P. Cysteine protease gene expression and proteolytic activity during floral development and senescence in ethylene-insensitive Gladiolus grandiflora[J]. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2004，13（2）：123-126.

[10]Burton K S，Partis M D，Wood D A，et al. Accumulation of serine proteinase in senescent sporophores of the cultivated mushroom，Agaricus bisporus[J]. Mycological Research，1997，101（2）：146-152.

[11]Heneghan M N，Porta C，Zhang C，et al. Characterization of serine proteinase expression in Agaricus bisporus and Coprinopsis cinerea by using green fluorescent protein and the A. bisporus SPR1 promoter[J]. Applied and Environmental Microbiology，2009，75（3）：792-801.

[12]Liu L W，Zhao L P，Gong Y Q，et al. DNA fingerprinting and genetic diversity analysis of late-bolting radish cultivars with RAPD，ISSR and SRAP markers[J]. Scientia Horticulturae，2008，116（3）：240-247.

[13]Wang C T，Wang C T，Cao Y P，et al. Effect of modified atmosphere packaging （MAP） with low and superatmospheric oxygen on the quality and antioxidant enzyme system of golden needle mushrooms （Flammulina velutipes） during postharvest storage[J]. European Food Research and Technology，2011，232（5）：851-860.

[14]Brennan M，Le Port G，Gormley R. Post-harvest treatment with citric acid or hydrogen peroxide to extend the shelf life of fresh sliced mushrooms[J]. LWT-Food Science and Technology，2000，33（4）：285-289.

[15]Akram K，Ahn J J，Yoon S R，et al. Quality attributes of Pleurotus eryngii following gamma irradiation[J]. Postharvest Biology and Technology，2012，66：42-47.

[16]Singh S P，Pal R K. Controlled atmosphere storage of guava （Psidium guajava L.） fruit [J]. Postharvest Biolotgy and Technology，2008，47（3）：296-306.

[17]Distefano S，Palma J M，Mccarthy I，et al. Proteolytic cleavage of plant proteins by peroxisomal endoproteases from senescent pea leaves[J]. Planta，1999，209（3）：308-313.

[18]Wagstaff C，Malcolm P，Rafiq A，et al. Programmed cell death （PCD） processes begin extremely early in Alstroemeria petal senescence[J]. New Phytologist，2003，160（1）：49-59.

[19]Xu X，Gookin T，Jiang C Z，et al. Genes associated with opening and senescence of Mirabilis jalapa flowers[J]. Journal of Experimental Botany，2007，58（8）：2193-2201.

[20]張鵬，王飛，張列峰，等. 絲氨酸內肽酶在黃瓜葉片衰老中的作用[J]. 植物生理與分子生物學學報，2006，32（5）：593-599.

[21]Ueda T，Seo S，Ohashi Y，et al. Circadian and senescence-enhanced expression of a tobacco cysteine protease gene[J]. Plant Molecular Biology，2000，44（5）：649-657.

[22]Mizushima N，Yoshimori T，Ohsumi Y. Role of the Apg12 conjugation system in mammalian autophagy[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2003，35（5）：553-561.

[23]Van Doorn W G，Woltering E J. Physiology and molecular biology of petal senescence[J]. Journal of Experimental Botany，2008，59（3）：453-480.

[24]Kingsnorth C S，Eastwood D C，Burton K S. Cloning and postharvest expression of serine proteinase transcripts in the cultivated mushroom Agaricus bisporus[J]. Fungal Genetics and Biology，2001，32（3）：135-144.