微囊藻毒素ELISA檢測(cè)方法的建立與評(píng)估

胡樂(lè)琴等

摘要：采用制備的微囊藻毒素（MC-LR）單克隆抗體制備包被抗原，建立MC-LR的ELISA檢測(cè)方法。該方法定量檢測(cè)區(qū)間LQD為0.20～4.00 μg/L，最低檢測(cè)限LOD為0.10 μg/L，最高檢測(cè)限HOD為8.00 μg/L，最佳包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對(duì)應(yīng)抗體稀釋度為1 ∶20 000左右，酶標(biāo)二抗工作稀釋度選擇為1 ∶6 000；應(yīng)用該方法對(duì)加標(biāo)水樣進(jìn)行檢測(cè)，綜合回收率為（98.0±10.7）%，各樣品檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)均小于10%。該ELISA方法準(zhǔn)確度良好，精密度優(yōu)良。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；單克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA；檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)： X17文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0340-04

我國(guó)是世界上藻災(zāi)最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，藻毒素嚴(yán)重威脅居民飲水安全和食品安全。我國(guó)主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水藍(lán)藻產(chǎn)生的一類(lèi)生物活性物質(zhì)，能夠?qū)θ梭w多個(gè)器官產(chǎn)生危害，危害最嚴(yán)重的靶器官是肝臟，長(zhǎng)時(shí)間低劑量接觸MCs會(huì)導(dǎo)致肝損傷和誘發(fā)癌癥[1-2]。有研究表明，我國(guó)肝癌多發(fā)區(qū)與當(dāng)?shù)厮懈吆康奈⒛叶舅赜嘘P(guān)[3-4]，MCs引發(fā)的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝細(xì)胞損傷、肝出血[5]。

預(yù)防藻毒素侵害最主要是保持水體清潔，防止藻類(lèi)過(guò)量生長(zhǎng)；同時(shí)，能夠精確及時(shí)地檢測(cè)毒素也是預(yù)防毒素污染的有效方法。我國(guó)淡水微囊藻毒素污染嚴(yán)重，但迄今為止尚沒(méi)有一種較合適于現(xiàn)場(chǎng)使用的藻毒素檢測(cè)方法，因此研制我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測(cè)淡水中微囊藻毒素的方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

藻毒檢測(cè)方法主要有色譜檢測(cè)、生物檢測(cè)、細(xì)胞檢測(cè)[6-8]，這些檢測(cè)技術(shù)或是需要昂貴的儀器、或是需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間、或是準(zhǔn)確率不夠。與其他檢測(cè)方法相比，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性高和檢測(cè)準(zhǔn)確快速的優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)上具有開(kāi)發(fā)前景，近年來(lái)在赤潮藻毒素快速檢測(cè)方面得到重視和發(fā)展。筆者所在實(shí)驗(yàn)室在成功制備高效價(jià)MC-LR單克隆抗體的基礎(chǔ)上，初步建立了檢測(cè) MC-LR 的間接競(jìng)爭(zhēng)酶免疫學(xué)檢測(cè)方法，為研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

微囊藻毒素單克隆抗體由筆者所在課題組研制；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2包被抗原的制備

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制備包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定

在96孔ELISA板上，檢測(cè)抗原按縱向排列，抗體按橫向排列。檢測(cè)抗原用包被緩沖液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）稀釋為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000這4個(gè)濃度，每濃度3個(gè)重復(fù)，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜；洗滌液后靜置1 min，重復(fù)洗滌3次；用0.1% BSA（用包被液進(jìn)行稀釋?zhuān)┑姆忾]液進(jìn)行封閉，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗滌3次，拍干。

MC-LR抗體濃度調(diào)為7.5 mg/mL，用高純水稀釋成如下梯度濃度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11個(gè)點(diǎn)；依次加入酶標(biāo)板上的1號(hào)至12號(hào)孔中，抗體體積為100 μL/孔，37 ℃溫育后洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG濃度選擇為1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次；顯色液為T(mén)MB；終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標(biāo)儀上測(cè)定D450 nm值，確定最佳包被抗原與抗體濃度。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

根據(jù)“1.3”節(jié)所得到的最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)，以及最佳二抗?jié)舛龋脴?biāo)準(zhǔn)系列稀釋的MC-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定。采用n=3個(gè)平行試驗(yàn)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5一抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

根據(jù)“1.3”節(jié)試驗(yàn)選取最佳的抗原、抗體稀釋度，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度為1 ∶20 000，作為ELISA的反應(yīng)條件。將MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品用高純水配制成如下梯度濃度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6個(gè)點(diǎn)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定，每孔50 μL標(biāo)準(zhǔn)品；同時(shí)加入用PBS配制好的單抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，一抗反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為30、60、90 min 3個(gè)組，每組3個(gè)平行；二抗體反應(yīng)時(shí)間固定為60 min。每個(gè)時(shí)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)設(shè)置2個(gè)平行。反應(yīng)結(jié)束后分別洗滌3次，拍干。

加二抗：酶標(biāo)二抗采用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，采用PBS稀釋?zhuān)靠准尤?00 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次，拍干。

顯色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室溫下固定反應(yīng)10 min。測(cè)定D450 nm值，選擇最佳一抗反應(yīng)時(shí)間。

1.6實(shí)際水樣的檢測(cè)（準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證）

1.6.1水樣的采集和預(yù)處理選取上海市不同來(lái)源的水樣，包括飲用水、地下水、景觀(guān)娛樂(lè)用水（游泳池和公園水樣）以及地表水（城市河道水體）14個(gè)樣品，每個(gè)水樣采集體積為10 mL，對(duì)較混濁的樣品采用0.45 μm的濾膜過(guò)濾。

1.6.2水樣的添加-回收測(cè)定在14個(gè)水樣中添加標(biāo)準(zhǔn)微囊藻毒素，每個(gè)樣品毒素的最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3個(gè)不同濃度。采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定樣品中毒素含量，每個(gè)水樣平行測(cè)定5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算水樣中MC-LR濃度。同時(shí)測(cè)定原水中的毒素含量，結(jié)果進(jìn)行比較，并計(jì)算回收率。回收率的計(jì)算方法如下：每個(gè)樣品平行測(cè)定5次，計(jì)算吸光度的平均值，樣品添加濃度（最終濃度）用X表示，未添加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測(cè)定平均值為x1，添加了標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測(cè)定平均值為x2，則回收率計(jì)算如式（1）。當(dāng)原水樣ELISA測(cè)定濃度超出本方法的檢測(cè)限，即小于0.1 μg/L時(shí)，視為未檢出，此時(shí)均按照x1=0計(jì)算回收率。

摘要：采用制備的微囊藻毒素（MC-LR）單克隆抗體制備包被抗原，建立MC-LR的ELISA檢測(cè)方法。該方法定量檢測(cè)區(qū)間LQD為0.20～4.00 μg/L，最低檢測(cè)限LOD為0.10 μg/L，最高檢測(cè)限HOD為8.00 μg/L，最佳包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對(duì)應(yīng)抗體稀釋度為1 ∶20 000左右，酶標(biāo)二抗工作稀釋度選擇為1 ∶6 000；應(yīng)用該方法對(duì)加標(biāo)水樣進(jìn)行檢測(cè)，綜合回收率為（98.0±10.7）%，各樣品檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)均小于10%。該ELISA方法準(zhǔn)確度良好，精密度優(yōu)良。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；單克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA；檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)： X17文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0340-04

我國(guó)是世界上藻災(zāi)最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，藻毒素嚴(yán)重威脅居民飲水安全和食品安全。我國(guó)主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水藍(lán)藻產(chǎn)生的一類(lèi)生物活性物質(zhì)，能夠?qū)θ梭w多個(gè)器官產(chǎn)生危害，危害最嚴(yán)重的靶器官是肝臟，長(zhǎng)時(shí)間低劑量接觸MCs會(huì)導(dǎo)致肝損傷和誘發(fā)癌癥[1-2]。有研究表明，我國(guó)肝癌多發(fā)區(qū)與當(dāng)?shù)厮懈吆康奈⒛叶舅赜嘘P(guān)[3-4]，MCs引發(fā)的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝細(xì)胞損傷、肝出血[5]。

預(yù)防藻毒素侵害最主要是保持水體清潔，防止藻類(lèi)過(guò)量生長(zhǎng)；同時(shí)，能夠精確及時(shí)地檢測(cè)毒素也是預(yù)防毒素污染的有效方法。我國(guó)淡水微囊藻毒素污染嚴(yán)重，但迄今為止尚沒(méi)有一種較合適于現(xiàn)場(chǎng)使用的藻毒素檢測(cè)方法，因此研制我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測(cè)淡水中微囊藻毒素的方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

藻毒檢測(cè)方法主要有色譜檢測(cè)、生物檢測(cè)、細(xì)胞檢測(cè)[6-8]，這些檢測(cè)技術(shù)或是需要昂貴的儀器、或是需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間、或是準(zhǔn)確率不夠。與其他檢測(cè)方法相比，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性高和檢測(cè)準(zhǔn)確快速的優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)上具有開(kāi)發(fā)前景，近年來(lái)在赤潮藻毒素快速檢測(cè)方面得到重視和發(fā)展。筆者所在實(shí)驗(yàn)室在成功制備高效價(jià)MC-LR單克隆抗體的基礎(chǔ)上，初步建立了檢測(cè) MC-LR 的間接競(jìng)爭(zhēng)酶免疫學(xué)檢測(cè)方法，為研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

微囊藻毒素單克隆抗體由筆者所在課題組研制；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2包被抗原的制備

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制備包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定

在96孔ELISA板上，檢測(cè)抗原按縱向排列，抗體按橫向排列。檢測(cè)抗原用包被緩沖液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）稀釋為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000這4個(gè)濃度，每濃度3個(gè)重復(fù)，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜；洗滌液后靜置1 min，重復(fù)洗滌3次；用0.1% BSA（用包被液進(jìn)行稀釋?zhuān)┑姆忾]液進(jìn)行封閉，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗滌3次，拍干。

MC-LR抗體濃度調(diào)為7.5 mg/mL，用高純水稀釋成如下梯度濃度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11個(gè)點(diǎn)；依次加入酶標(biāo)板上的1號(hào)至12號(hào)孔中，抗體體積為100 μL/孔，37 ℃溫育后洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG濃度選擇為1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次；顯色液為T(mén)MB；終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標(biāo)儀上測(cè)定D450 nm值，確定最佳包被抗原與抗體濃度。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

根據(jù)“1.3”節(jié)所得到的最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)，以及最佳二抗?jié)舛龋脴?biāo)準(zhǔn)系列稀釋的MC-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定。采用n=3個(gè)平行試驗(yàn)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5一抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

根據(jù)“1.3”節(jié)試驗(yàn)選取最佳的抗原、抗體稀釋度，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度為1 ∶20 000，作為ELISA的反應(yīng)條件。將MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品用高純水配制成如下梯度濃度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6個(gè)點(diǎn)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定，每孔50 μL標(biāo)準(zhǔn)品；同時(shí)加入用PBS配制好的單抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，一抗反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為30、60、90 min 3個(gè)組，每組3個(gè)平行；二抗體反應(yīng)時(shí)間固定為60 min。每個(gè)時(shí)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)設(shè)置2個(gè)平行。反應(yīng)結(jié)束后分別洗滌3次，拍干。

加二抗：酶標(biāo)二抗采用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，采用PBS稀釋?zhuān)靠准尤?00 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次，拍干。

顯色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室溫下固定反應(yīng)10 min。測(cè)定D450 nm值，選擇最佳一抗反應(yīng)時(shí)間。

1.6實(shí)際水樣的檢測(cè)（準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證）

1.6.1水樣的采集和預(yù)處理選取上海市不同來(lái)源的水樣，包括飲用水、地下水、景觀(guān)娛樂(lè)用水（游泳池和公園水樣）以及地表水（城市河道水體）14個(gè)樣品，每個(gè)水樣采集體積為10 mL，對(duì)較混濁的樣品采用0.45 μm的濾膜過(guò)濾。

1.6.2水樣的添加-回收測(cè)定在14個(gè)水樣中添加標(biāo)準(zhǔn)微囊藻毒素，每個(gè)樣品毒素的最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3個(gè)不同濃度。采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定樣品中毒素含量，每個(gè)水樣平行測(cè)定5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算水樣中MC-LR濃度。同時(shí)測(cè)定原水中的毒素含量，結(jié)果進(jìn)行比較，并計(jì)算回收率。回收率的計(jì)算方法如下：每個(gè)樣品平行測(cè)定5次，計(jì)算吸光度的平均值，樣品添加濃度（最終濃度）用X表示，未添加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測(cè)定平均值為x1，添加了標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測(cè)定平均值為x2，則回收率計(jì)算如式（1）。當(dāng)原水樣ELISA測(cè)定濃度超出本方法的檢測(cè)限，即小于0.1 μg/L時(shí)，視為未檢出，此時(shí)均按照x1=0計(jì)算回收率。

摘要：采用制備的微囊藻毒素（MC-LR）單克隆抗體制備包被抗原，建立MC-LR的ELISA檢測(cè)方法。該方法定量檢測(cè)區(qū)間LQD為0.20～4.00 μg/L，最低檢測(cè)限LOD為0.10 μg/L，最高檢測(cè)限HOD為8.00 μg/L，最佳包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對(duì)應(yīng)抗體稀釋度為1 ∶20 000左右，酶標(biāo)二抗工作稀釋度選擇為1 ∶6 000；應(yīng)用該方法對(duì)加標(biāo)水樣進(jìn)行檢測(cè)，綜合回收率為（98.0±10.7）%，各樣品檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)均小于10%。該ELISA方法準(zhǔn)確度良好，精密度優(yōu)良。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；單克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA；檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)： X17文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0340-04

我國(guó)是世界上藻災(zāi)最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，藻毒素嚴(yán)重威脅居民飲水安全和食品安全。我國(guó)主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水藍(lán)藻產(chǎn)生的一類(lèi)生物活性物質(zhì)，能夠?qū)θ梭w多個(gè)器官產(chǎn)生危害，危害最嚴(yán)重的靶器官是肝臟，長(zhǎng)時(shí)間低劑量接觸MCs會(huì)導(dǎo)致肝損傷和誘發(fā)癌癥[1-2]。有研究表明，我國(guó)肝癌多發(fā)區(qū)與當(dāng)?shù)厮懈吆康奈⒛叶舅赜嘘P(guān)[3-4]，MCs引發(fā)的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝細(xì)胞損傷、肝出血[5]。

預(yù)防藻毒素侵害最主要是保持水體清潔，防止藻類(lèi)過(guò)量生長(zhǎng)；同時(shí)，能夠精確及時(shí)地檢測(cè)毒素也是預(yù)防毒素污染的有效方法。我國(guó)淡水微囊藻毒素污染嚴(yán)重，但迄今為止尚沒(méi)有一種較合適于現(xiàn)場(chǎng)使用的藻毒素檢測(cè)方法，因此研制我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測(cè)淡水中微囊藻毒素的方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

藻毒檢測(cè)方法主要有色譜檢測(cè)、生物檢測(cè)、細(xì)胞檢測(cè)[6-8]，這些檢測(cè)技術(shù)或是需要昂貴的儀器、或是需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間、或是準(zhǔn)確率不夠。與其他檢測(cè)方法相比，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性高和檢測(cè)準(zhǔn)確快速的優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)上具有開(kāi)發(fā)前景，近年來(lái)在赤潮藻毒素快速檢測(cè)方面得到重視和發(fā)展。筆者所在實(shí)驗(yàn)室在成功制備高效價(jià)MC-LR單克隆抗體的基礎(chǔ)上，初步建立了檢測(cè) MC-LR 的間接競(jìng)爭(zhēng)酶免疫學(xué)檢測(cè)方法，為研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

微囊藻毒素單克隆抗體由筆者所在課題組研制；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2包被抗原的制備

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制備包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定

在96孔ELISA板上，檢測(cè)抗原按縱向排列，抗體按橫向排列。檢測(cè)抗原用包被緩沖液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）稀釋為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000這4個(gè)濃度，每濃度3個(gè)重復(fù)，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜；洗滌液后靜置1 min，重復(fù)洗滌3次；用0.1% BSA（用包被液進(jìn)行稀釋?zhuān)┑姆忾]液進(jìn)行封閉，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗滌3次，拍干。

MC-LR抗體濃度調(diào)為7.5 mg/mL，用高純水稀釋成如下梯度濃度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11個(gè)點(diǎn)；依次加入酶標(biāo)板上的1號(hào)至12號(hào)孔中，抗體體積為100 μL/孔，37 ℃溫育后洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG濃度選擇為1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次；顯色液為T(mén)MB；終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標(biāo)儀上測(cè)定D450 nm值，確定最佳包被抗原與抗體濃度。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

根據(jù)“1.3”節(jié)所得到的最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)，以及最佳二抗?jié)舛龋脴?biāo)準(zhǔn)系列稀釋的MC-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定。采用n=3個(gè)平行試驗(yàn)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5一抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

根據(jù)“1.3”節(jié)試驗(yàn)選取最佳的抗原、抗體稀釋度，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度為1 ∶20 000，作為ELISA的反應(yīng)條件。將MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品用高純水配制成如下梯度濃度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6個(gè)點(diǎn)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定，每孔50 μL標(biāo)準(zhǔn)品；同時(shí)加入用PBS配制好的單抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，一抗反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為30、60、90 min 3個(gè)組，每組3個(gè)平行；二抗體反應(yīng)時(shí)間固定為60 min。每個(gè)時(shí)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)設(shè)置2個(gè)平行。反應(yīng)結(jié)束后分別洗滌3次，拍干。

加二抗：酶標(biāo)二抗采用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，采用PBS稀釋?zhuān)靠准尤?00 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次，拍干。

顯色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室溫下固定反應(yīng)10 min。測(cè)定D450 nm值，選擇最佳一抗反應(yīng)時(shí)間。

1.6實(shí)際水樣的檢測(cè)（準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證）

1.6.1水樣的采集和預(yù)處理選取上海市不同來(lái)源的水樣，包括飲用水、地下水、景觀(guān)娛樂(lè)用水（游泳池和公園水樣）以及地表水（城市河道水體）14個(gè)樣品，每個(gè)水樣采集體積為10 mL，對(duì)較混濁的樣品采用0.45 μm的濾膜過(guò)濾。

1.6.2水樣的添加-回收測(cè)定在14個(gè)水樣中添加標(biāo)準(zhǔn)微囊藻毒素，每個(gè)樣品毒素的最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3個(gè)不同濃度。采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定樣品中毒素含量，每個(gè)水樣平行測(cè)定5次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算水樣中MC-LR濃度。同時(shí)測(cè)定原水中的毒素含量，結(jié)果進(jìn)行比較，并計(jì)算回收率。回收率的計(jì)算方法如下：每個(gè)樣品平行測(cè)定5次，計(jì)算吸光度的平均值，樣品添加濃度（最終濃度）用X表示，未添加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測(cè)定平均值為x1，添加了標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測(cè)定平均值為x2，則回收率計(jì)算如式（1）。當(dāng)原水樣ELISA測(cè)定濃度超出本方法的檢測(cè)限，即小于0.1 μg/L時(shí)，視為未檢出，此時(shí)均按照x1=0計(jì)算回收率。