微囊藻毒素ELISA檢測方法的建立與評估

胡樂琴等

摘要：采用制備的微囊藻毒素（MC-LR）單克隆抗體制備包被抗原，建立MC-LR的ELISA檢測方法。該方法定量檢測區(qū)間LQD為0.20～4.00 μg/L，最低檢測限LOD為0.10 μg/L，最高檢測限HOD為8.00 μg/L，最佳包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應抗體稀釋度為1 ∶20 000左右，酶標二抗工作稀釋度選擇為1 ∶6 000；應用該方法對加標水樣進行檢測，綜合回收率為（98.0±10.7）%，各樣品檢測結果變異系數(shù)均小于10%。該ELISA方法準確度良好，精密度優(yōu)良。

關鍵詞：微囊藻毒素；單克隆抗體；間接競爭ELISA；檢測

中圖分類號： X17文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0340-04

我國是世界上藻災最為嚴重的國家之一，藻毒素嚴重威脅居民飲水安全和食品安全。我國主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水藍藻產生的一類生物活性物質，能夠對人體多個器官產生危害，危害最嚴重的靶器官是肝臟，長時間低劑量接觸MCs會導致肝損傷和誘發(fā)癌癥[1-2]。有研究表明，我國肝癌多發(fā)區(qū)與當?shù)厮懈吆康奈⒛叶舅赜嘘P[3-4]，MCs引發(fā)的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝細胞損傷、肝出血[5]。

預防藻毒素侵害最主要是保持水體清潔，防止藻類過量生長；同時，能夠精確及時地檢測毒素也是預防毒素污染的有效方法。我國淡水微囊藻毒素污染嚴重，但迄今為止尚沒有一種較合適于現(xiàn)場使用的藻毒素檢測方法，因此研制我國自主知識產權的檢測淡水中微囊藻毒素的方法已成為當務之急。

藻毒檢測方法主要有色譜檢測、生物檢測、細胞檢測[6-8]，這些檢測技術或是需要昂貴的儀器、或是需要較長的檢測時間、或是準確率不夠。與其他檢測方法相比，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復性高和檢測準確快速的優(yōu)點，在現(xiàn)場快速檢測上具有開發(fā)前景，近年來在赤潮藻毒素快速檢測方面得到重視和發(fā)展。筆者所在實驗室在成功制備高效價MC-LR單克隆抗體的基礎上，初步建立了檢測 MC-LR 的間接競爭酶免疫學檢測方法，為研制具有自主知識產權的相關檢測試劑盒奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

微囊藻毒素單克隆抗體由筆者所在課題組研制；其他試劑均為國產分析純。

1.2包被抗原的制備

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制備包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定

在96孔ELISA板上，檢測抗原按縱向排列，抗體按橫向排列。檢測抗原用包被緩沖液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）稀釋為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000這4個濃度，每濃度3個重復，每孔100 μL，4 ℃過夜；洗滌液后靜置1 min，重復洗滌3次；用0.1% BSA（用包被液進行稀釋）的封閉液進行封閉，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗滌3次，拍干。

MC-LR抗體濃度調為7.5 mg/mL，用高純水稀釋成如下梯度濃度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11個點；依次加入酶標板上的1號至12號孔中，抗體體積為100 μL/孔，37 ℃溫育后洗滌3次；加入HRP標記的羊抗鼠IgG，酶標二抗羊抗鼠IgG濃度選擇為1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次；顯色液為TMB；終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標儀上測定D450 nm值，確定最佳包被抗原與抗體濃度。

1.4標準曲線的測定

根據“1.3”節(jié)所得到的最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)，以及最佳二抗?jié)舛龋脴藴氏盗邢♂尩腗C-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照間接競爭ELISA測定。采用n=3個平行試驗，獲得標準曲線。

1.5一抗最佳反應時間的確定

根據“1.3”節(jié)試驗選取最佳的抗原、抗體稀釋度，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應的抗體稀釋度為1 ∶20 000，作為ELISA的反應條件。將MC-LR標準品用高純水配制成如下梯度濃度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6個點，進行標準曲線測定，每孔50 μL標準品；同時加入用PBS配制好的單抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，一抗反應時間設定為30、60、90 min 3個組，每組3個平行；二抗體反應時間固定為60 min。每個時間內標準曲線設置2個平行。反應結束后分別洗滌3次，拍干。

加二抗：酶標二抗采用HRP標記的羊抗鼠IgG，采用PBS稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次，拍干。

顯色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室溫下固定反應10 min。測定D450 nm值，選擇最佳一抗反應時間。

1.6實際水樣的檢測（準確度和精密度驗證）

1.6.1水樣的采集和預處理選取上海市不同來源的水樣，包括飲用水、地下水、景觀娛樂用水（游泳池和公園水樣）以及地表水（城市河道水體）14個樣品，每個水樣采集體積為10 mL，對較混濁的樣品采用0.45 μm的濾膜過濾。

1.6.2水樣的添加-回收測定在14個水樣中添加標準微囊藻毒素，每個樣品毒素的最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3個不同濃度。采用直接競爭ELISA測定樣品中毒素含量，每個水樣平行測定5次，根據標準曲線計算水樣中MC-LR濃度。同時測定原水中的毒素含量，結果進行比較，并計算回收率。回收率的計算方法如下：每個樣品平行測定5次，計算吸光度的平均值，樣品添加濃度（最終濃度）用X表示，未添加標準品的樣品測定平均值為x1，添加了標準品的樣品測定平均值為x2，則回收率計算如式（1）。當原水樣ELISA測定濃度超出本方法的檢測限，即小于0.1 μg/L時，視為未檢出，此時均按照x1=0計算回收率。

摘要：采用制備的微囊藻毒素（MC-LR）單克隆抗體制備包被抗原，建立MC-LR的ELISA檢測方法。該方法定量檢測區(qū)間LQD為0.20～4.00 μg/L，最低檢測限LOD為0.10 μg/L，最高檢測限HOD為8.00 μg/L，最佳包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應抗體稀釋度為1 ∶20 000左右，酶標二抗工作稀釋度選擇為1 ∶6 000；應用該方法對加標水樣進行檢測，綜合回收率為（98.0±10.7）%，各樣品檢測結果變異系數(shù)均小于10%。該ELISA方法準確度良好，精密度優(yōu)良。

關鍵詞：微囊藻毒素；單克隆抗體；間接競爭ELISA；檢測

中圖分類號： X17文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0340-04

我國是世界上藻災最為嚴重的國家之一，藻毒素嚴重威脅居民飲水安全和食品安全。我國主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水藍藻產生的一類生物活性物質，能夠對人體多個器官產生危害，危害最嚴重的靶器官是肝臟，長時間低劑量接觸MCs會導致肝損傷和誘發(fā)癌癥[1-2]。有研究表明，我國肝癌多發(fā)區(qū)與當?shù)厮懈吆康奈⒛叶舅赜嘘P[3-4]，MCs引發(fā)的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝細胞損傷、肝出血[5]。

預防藻毒素侵害最主要是保持水體清潔，防止藻類過量生長；同時，能夠精確及時地檢測毒素也是預防毒素污染的有效方法。我國淡水微囊藻毒素污染嚴重，但迄今為止尚沒有一種較合適于現(xiàn)場使用的藻毒素檢測方法，因此研制我國自主知識產權的檢測淡水中微囊藻毒素的方法已成為當務之急。

藻毒檢測方法主要有色譜檢測、生物檢測、細胞檢測[6-8]，這些檢測技術或是需要昂貴的儀器、或是需要較長的檢測時間、或是準確率不夠。與其他檢測方法相比，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復性高和檢測準確快速的優(yōu)點，在現(xiàn)場快速檢測上具有開發(fā)前景，近年來在赤潮藻毒素快速檢測方面得到重視和發(fā)展。筆者所在實驗室在成功制備高效價MC-LR單克隆抗體的基礎上，初步建立了檢測 MC-LR 的間接競爭酶免疫學檢測方法，為研制具有自主知識產權的相關檢測試劑盒奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

微囊藻毒素單克隆抗體由筆者所在課題組研制；其他試劑均為國產分析純。

1.2包被抗原的制備

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制備包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定

在96孔ELISA板上，檢測抗原按縱向排列，抗體按橫向排列。檢測抗原用包被緩沖液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）稀釋為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000這4個濃度，每濃度3個重復，每孔100 μL，4 ℃過夜；洗滌液后靜置1 min，重復洗滌3次；用0.1% BSA（用包被液進行稀釋）的封閉液進行封閉，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗滌3次，拍干。

MC-LR抗體濃度調為7.5 mg/mL，用高純水稀釋成如下梯度濃度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11個點；依次加入酶標板上的1號至12號孔中，抗體體積為100 μL/孔，37 ℃溫育后洗滌3次；加入HRP標記的羊抗鼠IgG，酶標二抗羊抗鼠IgG濃度選擇為1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次；顯色液為TMB；終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標儀上測定D450 nm值，確定最佳包被抗原與抗體濃度。

1.4標準曲線的測定

根據“1.3”節(jié)所得到的最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)，以及最佳二抗?jié)舛龋脴藴氏盗邢♂尩腗C-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照間接競爭ELISA測定。采用n=3個平行試驗，獲得標準曲線。

1.5一抗最佳反應時間的確定

根據“1.3”節(jié)試驗選取最佳的抗原、抗體稀釋度，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應的抗體稀釋度為1 ∶20 000，作為ELISA的反應條件。將MC-LR標準品用高純水配制成如下梯度濃度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6個點，進行標準曲線測定，每孔50 μL標準品；同時加入用PBS配制好的單抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，一抗反應時間設定為30、60、90 min 3個組，每組3個平行；二抗體反應時間固定為60 min。每個時間內標準曲線設置2個平行。反應結束后分別洗滌3次，拍干。

加二抗：酶標二抗采用HRP標記的羊抗鼠IgG，采用PBS稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次，拍干。

顯色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室溫下固定反應10 min。測定D450 nm值，選擇最佳一抗反應時間。

1.6實際水樣的檢測（準確度和精密度驗證）

1.6.1水樣的采集和預處理選取上海市不同來源的水樣，包括飲用水、地下水、景觀娛樂用水（游泳池和公園水樣）以及地表水（城市河道水體）14個樣品，每個水樣采集體積為10 mL，對較混濁的樣品采用0.45 μm的濾膜過濾。

1.6.2水樣的添加-回收測定在14個水樣中添加標準微囊藻毒素，每個樣品毒素的最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3個不同濃度。采用直接競爭ELISA測定樣品中毒素含量，每個水樣平行測定5次，根據標準曲線計算水樣中MC-LR濃度。同時測定原水中的毒素含量，結果進行比較，并計算回收率。回收率的計算方法如下：每個樣品平行測定5次，計算吸光度的平均值，樣品添加濃度（最終濃度）用X表示，未添加標準品的樣品測定平均值為x1，添加了標準品的樣品測定平均值為x2，則回收率計算如式（1）。當原水樣ELISA測定濃度超出本方法的檢測限，即小于0.1 μg/L時，視為未檢出，此時均按照x1=0計算回收率。

摘要：采用制備的微囊藻毒素（MC-LR）單克隆抗體制備包被抗原，建立MC-LR的ELISA檢測方法。該方法定量檢測區(qū)間LQD為0.20～4.00 μg/L，最低檢測限LOD為0.10 μg/L，最高檢測限HOD為8.00 μg/L，最佳包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應抗體稀釋度為1 ∶20 000左右，酶標二抗工作稀釋度選擇為1 ∶6 000；應用該方法對加標水樣進行檢測，綜合回收率為（98.0±10.7）%，各樣品檢測結果變異系數(shù)均小于10%。該ELISA方法準確度良好，精密度優(yōu)良。

關鍵詞：微囊藻毒素；單克隆抗體；間接競爭ELISA；檢測

中圖分類號： X17文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0340-04

我國是世界上藻災最為嚴重的國家之一，藻毒素嚴重威脅居民飲水安全和食品安全。我國主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水藍藻產生的一類生物活性物質，能夠對人體多個器官產生危害，危害最嚴重的靶器官是肝臟，長時間低劑量接觸MCs會導致肝損傷和誘發(fā)癌癥[1-2]。有研究表明，我國肝癌多發(fā)區(qū)與當?shù)厮懈吆康奈⒛叶舅赜嘘P[3-4]，MCs引發(fā)的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝細胞損傷、肝出血[5]。

預防藻毒素侵害最主要是保持水體清潔，防止藻類過量生長；同時，能夠精確及時地檢測毒素也是預防毒素污染的有效方法。我國淡水微囊藻毒素污染嚴重，但迄今為止尚沒有一種較合適于現(xiàn)場使用的藻毒素檢測方法，因此研制我國自主知識產權的檢測淡水中微囊藻毒素的方法已成為當務之急。

藻毒檢測方法主要有色譜檢測、生物檢測、細胞檢測[6-8]，這些檢測技術或是需要昂貴的儀器、或是需要較長的檢測時間、或是準確率不夠。與其他檢測方法相比，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復性高和檢測準確快速的優(yōu)點，在現(xiàn)場快速檢測上具有開發(fā)前景，近年來在赤潮藻毒素快速檢測方面得到重視和發(fā)展。筆者所在實驗室在成功制備高效價MC-LR單克隆抗體的基礎上，初步建立了檢測 MC-LR 的間接競爭酶免疫學檢測方法，為研制具有自主知識產權的相關檢測試劑盒奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

微囊藻毒素單克隆抗體由筆者所在課題組研制；其他試劑均為國產分析純。

1.2包被抗原的制備

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制備包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定

在96孔ELISA板上，檢測抗原按縱向排列，抗體按橫向排列。檢測抗原用包被緩沖液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）稀釋為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000這4個濃度，每濃度3個重復，每孔100 μL，4 ℃過夜；洗滌液后靜置1 min，重復洗滌3次；用0.1% BSA（用包被液進行稀釋）的封閉液進行封閉，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗滌3次，拍干。

MC-LR抗體濃度調為7.5 mg/mL，用高純水稀釋成如下梯度濃度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11個點；依次加入酶標板上的1號至12號孔中，抗體體積為100 μL/孔，37 ℃溫育后洗滌3次；加入HRP標記的羊抗鼠IgG，酶標二抗羊抗鼠IgG濃度選擇為1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次；顯色液為TMB；終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標儀上測定D450 nm值，確定最佳包被抗原與抗體濃度。

1.4標準曲線的測定

根據“1.3”節(jié)所得到的最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)，以及最佳二抗?jié)舛龋脴藴氏盗邢♂尩腗C-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照間接競爭ELISA測定。采用n=3個平行試驗，獲得標準曲線。

1.5一抗最佳反應時間的確定

根據“1.3”節(jié)試驗選取最佳的抗原、抗體稀釋度，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應的抗體稀釋度為1 ∶20 000，作為ELISA的反應條件。將MC-LR標準品用高純水配制成如下梯度濃度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6個點，進行標準曲線測定，每孔50 μL標準品；同時加入用PBS配制好的單抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，一抗反應時間設定為30、60、90 min 3個組，每組3個平行；二抗體反應時間固定為60 min。每個時間內標準曲線設置2個平行。反應結束后分別洗滌3次，拍干。

加二抗：酶標二抗采用HRP標記的羊抗鼠IgG，采用PBS稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次，拍干。

顯色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室溫下固定反應10 min。測定D450 nm值，選擇最佳一抗反應時間。

1.6實際水樣的檢測（準確度和精密度驗證）

1.6.1水樣的采集和預處理選取上海市不同來源的水樣，包括飲用水、地下水、景觀娛樂用水（游泳池和公園水樣）以及地表水（城市河道水體）14個樣品，每個水樣采集體積為10 mL，對較混濁的樣品采用0.45 μm的濾膜過濾。

1.6.2水樣的添加-回收測定在14個水樣中添加標準微囊藻毒素，每個樣品毒素的最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3個不同濃度。采用直接競爭ELISA測定樣品中毒素含量，每個水樣平行測定5次，根據標準曲線計算水樣中MC-LR濃度。同時測定原水中的毒素含量，結果進行比較，并計算回收率。回收率的計算方法如下：每個樣品平行測定5次，計算吸光度的平均值，樣品添加濃度（最終濃度）用X表示，未添加標準品的樣品測定平均值為x1，添加了標準品的樣品測定平均值為x2，則回收率計算如式（1）。當原水樣ELISA測定濃度超出本方法的檢測限，即小于0.1 μg/L時，視為未檢出，此時均按照x1=0計算回收率。