微囊藻毒素ELISA檢測方法的建立與評估

胡樂琴等

摘要：采用制備的微囊藻毒素（MC-LR）單克隆抗體制備包被抗原，建立MC-LR的ELISA檢測方法。該方法定量檢測區(qū)間LQD為0.20～4.00 μg/L，最低檢測限LOD為0.10 μg/L，最高檢測限HOD為8.00 μg/L，最佳包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應抗體稀釋度為1 ∶20 000左右，酶標二抗工作稀釋度選擇為1 ∶6 000；應用該方法對加標水樣進行檢測，綜合回收率為（98.0±10.7）%，各樣品檢測結(jié)果變異系數(shù)均小于10%。該ELISA方法準確度良好，精密度優(yōu)良。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；單克隆抗體；間接競爭ELISA；檢測

中圖分類號： X17文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0340-04

我國是世界上藻災最為嚴重的國家之一，藻毒素嚴重威脅居民飲水安全和食品安全。我國主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水藍藻產(chǎn)生的一類生物活性物質(zhì)，能夠?qū)θ梭w多個器官產(chǎn)生危害，危害最嚴重的靶器官是肝臟，長時間低劑量接觸MCs會導致肝損傷和誘發(fā)癌癥[1-2]。有研究表明，我國肝癌多發(fā)區(qū)與當?shù)厮懈吆康奈⒛叶舅赜嘘P(guān)[3-4]，MCs引發(fā)的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝細胞損傷、肝出血[5]。

預防藻毒素侵害最主要是保持水體清潔，防止藻類過量生長；同時，能夠精確及時地檢測毒素也是預防毒素污染的有效方法。我國淡水微囊藻毒素污染嚴重，但迄今為止尚沒有一種較合適于現(xiàn)場使用的藻毒素檢測方法，因此研制我國自主知識產(chǎn)權(quán)的檢測淡水中微囊藻毒素的方法已成為當務之急。

藻毒檢測方法主要有色譜檢測、生物檢測、細胞檢測[6-8]，這些檢測技術(shù)或是需要昂貴的儀器、或是需要較長的檢測時間、或是準確率不夠。與其他檢測方法相比，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復性高和檢測準確快速的優(yōu)點，在現(xiàn)場快速檢測上具有開發(fā)前景，近年來在赤潮藻毒素快速檢測方面得到重視和發(fā)展。筆者所在實驗室在成功制備高效價MC-LR單克隆抗體的基礎(chǔ)上，初步建立了檢測 MC-LR 的間接競爭酶免疫學檢測方法，為研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

微囊藻毒素單克隆抗體由筆者所在課題組研制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2包被抗原的制備

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制備包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定

在96孔ELISA板上，檢測抗原按縱向排列，抗體按橫向排列。檢測抗原用包被緩沖液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）稀釋為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000這4個濃度，每濃度3個重復，每孔100 μL，4 ℃過夜；洗滌液后靜置1 min，重復洗滌3次；用0.1% BSA（用包被液進行稀釋）的封閉液進行封閉，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗滌3次，拍干。

MC-LR抗體濃度調(diào)為7.5 mg/mL，用高純水稀釋成如下梯度濃度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11個點；依次加入酶標板上的1號至12號孔中，抗體體積為100 μL/孔，37 ℃溫育后洗滌3次；加入HRP標記的羊抗鼠IgG，酶標二抗羊抗鼠IgG濃度選擇為1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次；顯色液為TMB；終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標儀上測定D450 nm值，確定最佳包被抗原與抗體濃度。

1.4標準曲線的測定

根據(jù)“1.3”節(jié)所得到的最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)，以及最佳二抗?jié)舛龋脴藴氏盗邢♂尩腗C-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照間接競爭ELISA測定。采用n=3個平行試驗，獲得標準曲線。

1.5一抗最佳反應時間的確定

根據(jù)“1.3”節(jié)試驗選取最佳的抗原、抗體稀釋度，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應的抗體稀釋度為1 ∶20 000，作為ELISA的反應條件。將MC-LR標準品用高純水配制成如下梯度濃度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6個點，進行標準曲線測定，每孔50 μL標準品；同時加入用PBS配制好的單抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，一抗反應時間設(shè)定為30、60、90 min 3個組，每組3個平行；二抗體反應時間固定為60 min。每個時間內(nèi)標準曲線設(shè)置2個平行。反應結(jié)束后分別洗滌3次，拍干。

加二抗：酶標二抗采用HRP標記的羊抗鼠IgG，采用PBS稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次，拍干。

顯色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室溫下固定反應10 min。測定D450 nm值，選擇最佳一抗反應時間。

1.6實際水樣的檢測（準確度和精密度驗證）

1.6.1水樣的采集和預處理選取上海市不同來源的水樣，包括飲用水、地下水、景觀娛樂用水（游泳池和公園水樣）以及地表水（城市河道水體）14個樣品，每個水樣采集體積為10 mL，對較混濁的樣品采用0.45 μm的濾膜過濾。

1.6.2水樣的添加-回收測定在14個水樣中添加標準微囊藻毒素，每個樣品毒素的最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3個不同濃度。采用直接競爭ELISA測定樣品中毒素含量，每個水樣平行測定5次，根據(jù)標準曲線計算水樣中MC-LR濃度。同時測定原水中的毒素含量，結(jié)果進行比較，并計算回收率。回收率的計算方法如下：每個樣品平行測定5次，計算吸光度的平均值，樣品添加濃度（最終濃度）用X表示，未添加標準品的樣品測定平均值為x1，添加了標準品的樣品測定平均值為x2，則回收率計算如式（1）。當原水樣ELISA測定濃度超出本方法的檢測限，即小于0.1 μg/L時，視為未檢出，此時均按照x1=0計算回收率。

摘要：采用制備的微囊藻毒素（MC-LR）單克隆抗體制備包被抗原，建立MC-LR的ELISA檢測方法。該方法定量檢測區(qū)間LQD為0.20～4.00 μg/L，最低檢測限LOD為0.10 μg/L，最高檢測限HOD為8.00 μg/L，最佳包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應抗體稀釋度為1 ∶20 000左右，酶標二抗工作稀釋度選擇為1 ∶6 000；應用該方法對加標水樣進行檢測，綜合回收率為（98.0±10.7）%，各樣品檢測結(jié)果變異系數(shù)均小于10%。該ELISA方法準確度良好，精密度優(yōu)良。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；單克隆抗體；間接競爭ELISA；檢測

中圖分類號： X17文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0340-04

我國是世界上藻災最為嚴重的國家之一，藻毒素嚴重威脅居民飲水安全和食品安全。我國主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水藍藻產(chǎn)生的一類生物活性物質(zhì)，能夠?qū)θ梭w多個器官產(chǎn)生危害，危害最嚴重的靶器官是肝臟，長時間低劑量接觸MCs會導致肝損傷和誘發(fā)癌癥[1-2]。有研究表明，我國肝癌多發(fā)區(qū)與當?shù)厮懈吆康奈⒛叶舅赜嘘P(guān)[3-4]，MCs引發(fā)的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝細胞損傷、肝出血[5]。

預防藻毒素侵害最主要是保持水體清潔，防止藻類過量生長；同時，能夠精確及時地檢測毒素也是預防毒素污染的有效方法。我國淡水微囊藻毒素污染嚴重，但迄今為止尚沒有一種較合適于現(xiàn)場使用的藻毒素檢測方法，因此研制我國自主知識產(chǎn)權(quán)的檢測淡水中微囊藻毒素的方法已成為當務之急。

藻毒檢測方法主要有色譜檢測、生物檢測、細胞檢測[6-8]，這些檢測技術(shù)或是需要昂貴的儀器、或是需要較長的檢測時間、或是準確率不夠。與其他檢測方法相比，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復性高和檢測準確快速的優(yōu)點，在現(xiàn)場快速檢測上具有開發(fā)前景，近年來在赤潮藻毒素快速檢測方面得到重視和發(fā)展。筆者所在實驗室在成功制備高效價MC-LR單克隆抗體的基礎(chǔ)上，初步建立了檢測 MC-LR 的間接競爭酶免疫學檢測方法，為研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

微囊藻毒素單克隆抗體由筆者所在課題組研制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2包被抗原的制備

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制備包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定

在96孔ELISA板上，檢測抗原按縱向排列，抗體按橫向排列。檢測抗原用包被緩沖液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）稀釋為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000這4個濃度，每濃度3個重復，每孔100 μL，4 ℃過夜；洗滌液后靜置1 min，重復洗滌3次；用0.1% BSA（用包被液進行稀釋）的封閉液進行封閉，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗滌3次，拍干。

MC-LR抗體濃度調(diào)為7.5 mg/mL，用高純水稀釋成如下梯度濃度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11個點；依次加入酶標板上的1號至12號孔中，抗體體積為100 μL/孔，37 ℃溫育后洗滌3次；加入HRP標記的羊抗鼠IgG，酶標二抗羊抗鼠IgG濃度選擇為1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次；顯色液為TMB；終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標儀上測定D450 nm值，確定最佳包被抗原與抗體濃度。

1.4標準曲線的測定

根據(jù)“1.3”節(jié)所得到的最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)，以及最佳二抗?jié)舛龋脴藴氏盗邢♂尩腗C-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照間接競爭ELISA測定。采用n=3個平行試驗，獲得標準曲線。

1.5一抗最佳反應時間的確定

根據(jù)“1.3”節(jié)試驗選取最佳的抗原、抗體稀釋度，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應的抗體稀釋度為1 ∶20 000，作為ELISA的反應條件。將MC-LR標準品用高純水配制成如下梯度濃度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6個點，進行標準曲線測定，每孔50 μL標準品；同時加入用PBS配制好的單抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，一抗反應時間設(shè)定為30、60、90 min 3個組，每組3個平行；二抗體反應時間固定為60 min。每個時間內(nèi)標準曲線設(shè)置2個平行。反應結(jié)束后分別洗滌3次，拍干。

加二抗：酶標二抗采用HRP標記的羊抗鼠IgG，采用PBS稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次，拍干。

顯色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室溫下固定反應10 min。測定D450 nm值，選擇最佳一抗反應時間。

1.6實際水樣的檢測（準確度和精密度驗證）

1.6.1水樣的采集和預處理選取上海市不同來源的水樣，包括飲用水、地下水、景觀娛樂用水（游泳池和公園水樣）以及地表水（城市河道水體）14個樣品，每個水樣采集體積為10 mL，對較混濁的樣品采用0.45 μm的濾膜過濾。

1.6.2水樣的添加-回收測定在14個水樣中添加標準微囊藻毒素，每個樣品毒素的最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3個不同濃度。采用直接競爭ELISA測定樣品中毒素含量，每個水樣平行測定5次，根據(jù)標準曲線計算水樣中MC-LR濃度。同時測定原水中的毒素含量，結(jié)果進行比較，并計算回收率。回收率的計算方法如下：每個樣品平行測定5次，計算吸光度的平均值，樣品添加濃度（最終濃度）用X表示，未添加標準品的樣品測定平均值為x1，添加了標準品的樣品測定平均值為x2，則回收率計算如式（1）。當原水樣ELISA測定濃度超出本方法的檢測限，即小于0.1 μg/L時，視為未檢出，此時均按照x1=0計算回收率。

摘要：采用制備的微囊藻毒素（MC-LR）單克隆抗體制備包被抗原，建立MC-LR的ELISA檢測方法。該方法定量檢測區(qū)間LQD為0.20～4.00 μg/L，最低檢測限LOD為0.10 μg/L，最高檢測限HOD為8.00 μg/L，最佳包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應抗體稀釋度為1 ∶20 000左右，酶標二抗工作稀釋度選擇為1 ∶6 000；應用該方法對加標水樣進行檢測，綜合回收率為（98.0±10.7）%，各樣品檢測結(jié)果變異系數(shù)均小于10%。該ELISA方法準確度良好，精密度優(yōu)良。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；單克隆抗體；間接競爭ELISA；檢測

中圖分類號： X17文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0340-04

我國是世界上藻災最為嚴重的國家之一，藻毒素嚴重威脅居民飲水安全和食品安全。我國主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水藍藻產(chǎn)生的一類生物活性物質(zhì)，能夠?qū)θ梭w多個器官產(chǎn)生危害，危害最嚴重的靶器官是肝臟，長時間低劑量接觸MCs會導致肝損傷和誘發(fā)癌癥[1-2]。有研究表明，我國肝癌多發(fā)區(qū)與當?shù)厮懈吆康奈⒛叶舅赜嘘P(guān)[3-4]，MCs引發(fā)的急性肝中毒癥狀表現(xiàn)為肝細胞損傷、肝出血[5]。

預防藻毒素侵害最主要是保持水體清潔，防止藻類過量生長；同時，能夠精確及時地檢測毒素也是預防毒素污染的有效方法。我國淡水微囊藻毒素污染嚴重，但迄今為止尚沒有一種較合適于現(xiàn)場使用的藻毒素檢測方法，因此研制我國自主知識產(chǎn)權(quán)的檢測淡水中微囊藻毒素的方法已成為當務之急。

藻毒檢測方法主要有色譜檢測、生物檢測、細胞檢測[6-8]，這些檢測技術(shù)或是需要昂貴的儀器、或是需要較長的檢測時間、或是準確率不夠。與其他檢測方法相比，酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復性高和檢測準確快速的優(yōu)點，在現(xiàn)場快速檢測上具有開發(fā)前景，近年來在赤潮藻毒素快速檢測方面得到重視和發(fā)展。筆者所在實驗室在成功制備高效價MC-LR單克隆抗體的基礎(chǔ)上，初步建立了檢測 MC-LR 的間接競爭酶免疫學檢測方法，為研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

微囊藻毒素單克隆抗體由筆者所在課題組研制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2包被抗原的制備

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制備包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗原、抗體最佳稀釋濃度的確定

在96孔ELISA板上，檢測抗原按縱向排列，抗體按橫向排列。檢測抗原用包被緩沖液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液）稀釋為1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000這4個濃度，每濃度3個重復，每孔100 μL，4 ℃過夜；洗滌液后靜置1 min，重復洗滌3次；用0.1% BSA（用包被液進行稀釋）的封閉液進行封閉，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗滌3次，拍干。

MC-LR抗體濃度調(diào)為7.5 mg/mL，用高純水稀釋成如下梯度濃度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11個點；依次加入酶標板上的1號至12號孔中，抗體體積為100 μL/孔，37 ℃溫育后洗滌3次；加入HRP標記的羊抗鼠IgG，酶標二抗羊抗鼠IgG濃度選擇為1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次；顯色液為TMB；終止液為 2 mol/L H2SO4。在酶標儀上測定D450 nm值，確定最佳包被抗原與抗體濃度。

1.4標準曲線的測定

根據(jù)“1.3”節(jié)所得到的最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)，以及最佳二抗?jié)舛龋脴藴氏盗邢♂尩腗C-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照間接競爭ELISA測定。采用n=3個平行試驗，獲得標準曲線。

1.5一抗最佳反應時間的確定

根據(jù)“1.3”節(jié)試驗選取最佳的抗原、抗體稀釋度，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，對應的抗體稀釋度為1 ∶20 000，作為ELISA的反應條件。將MC-LR標準品用高純水配制成如下梯度濃度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6個點，進行標準曲線測定，每孔50 μL標準品；同時加入用PBS配制好的單抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中溫育，一抗反應時間設(shè)定為30、60、90 min 3個組，每組3個平行；二抗體反應時間固定為60 min。每個時間內(nèi)標準曲線設(shè)置2個平行。反應結(jié)束后分別洗滌3次，拍干。

加二抗：酶標二抗采用HRP標記的羊抗鼠IgG，采用PBS稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌4次，拍干。

顯色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室溫下固定反應10 min。測定D450 nm值，選擇最佳一抗反應時間。

1.6實際水樣的檢測（準確度和精密度驗證）

1.6.1水樣的采集和預處理選取上海市不同來源的水樣，包括飲用水、地下水、景觀娛樂用水（游泳池和公園水樣）以及地表水（城市河道水體）14個樣品，每個水樣采集體積為10 mL，對較混濁的樣品采用0.45 μm的濾膜過濾。

1.6.2水樣的添加-回收測定在14個水樣中添加標準微囊藻毒素，每個樣品毒素的最終濃度分別為0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3個不同濃度。采用直接競爭ELISA測定樣品中毒素含量，每個水樣平行測定5次，根據(jù)標準曲線計算水樣中MC-LR濃度。同時測定原水中的毒素含量，結(jié)果進行比較，并計算回收率。回收率的計算方法如下：每個樣品平行測定5次，計算吸光度的平均值，樣品添加濃度（最終濃度）用X表示，未添加標準品的樣品測定平均值為x1，添加了標準品的樣品測定平均值為x2，則回收率計算如式（1）。當原水樣ELISA測定濃度超出本方法的檢測限，即小于0.1 μg/L時，視為未檢出，此時均按照x1=0計算回收率。