1株產3—羥基丙酸菌株的分離和鑒定

吳孔陽等

摘要：通過平板篩選，從土壤中分離出1株菌株Y31，并對該菌株進行形態觀察、生理生化試驗、16S rDNA序列分析以及產物的薄層層析鑒定。結果表明，Y31菌株初步鑒定為短乳桿菌變種，能夠以丙酸為唯一碳源發酵生產3-羥基丙酸。

關鍵詞：3-羥基丙酸；分離；鑒定；短乳桿菌；薄層層析

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0381-03

3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，別稱β-hydroxypropionic acid，簡寫3-HP） 是一種重要的化工平臺產品，被美國能源部列為當今世界12 種最具潛力的化工產品之一[1]。目前，3-HP主要通過丙烯酸水合法、β-丙內酯水解法等化學合成方法制備，在生產過程中依賴一些特殊條件，且具有一定的危險性[2]。而微生物技術方法逐漸成為當前3-HP生物合成的研究熱點[3-6]，主要是通過自然選育、基因工程或代謝工程技術選育優良的3-HP產生菌。從自然環境中選育的3-HP菌株主要有克雷伯氏菌、假絲酵母、假單胞菌、羅伊氏乳桿菌和紅串紅球菌等[2，7-10]。為了獲得其他具有潛在應用價值的3-HP產生菌，本研究從不同的土壤環境中分離產3-HP菌株，并通過形態觀察、生理生化試驗和16S rDNA序列分析等方法對分離菌株進行初步鑒定，以期為豐富產3-HP的微生物資源提供技術參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品土壤樣品采集自果園、耕田、化工廠周邊污水環境。

1.1.2培養基（1）初篩培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、瓊脂20 g/L，pH值自然，高壓滅菌后加入 0.1%～1.0% 丙酸。（2）復篩培養基：蛋白胨20 g/L、酵母膏 10 g/L、瓊脂20 g/L、pH值自然，高壓滅菌后加入05%丙酸。（3）發酵培養基：蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L，pH值自然，高壓滅菌后加入0.5%丙酸。（4）斜面培養基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、瓊脂20 g/L，pH值自然。 菌落形態特征和生理生化試驗所用培養基參考《微生物學實驗教程》和《微生物學實驗技術》等相關資料[11-12]。

1.1.3主要試劑DNA Marker購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；Taq 酶、dNTP購自TaKaRa公司；3-HP標準品購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；細菌生理生化微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；TLC Silica gel 60 F254硅膠薄層層析板購自Merck公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1菌株初篩與復篩分別將樣品少許放入100 mL含有玻璃珠的無菌水中，輕輕混勻后靜置2 h，然后吸取0.1 mL懸浮液涂布于含有不同濃度丙酸的初篩培養基上。涂布完畢后，將平板倒置于30 ℃培養箱中放置24～72 h，用無菌牙簽將初篩平板上的單個菌落轉接到復篩培養基上，繼續培養24～48 h，初步得到能夠在復篩培養基中生長的菌株。將復篩的菌株分別接種于10 mL發酵培養基中，在30 ℃、160 r/min的搖床中發酵48 h。發酵結束后，離心去除菌體得到發酵上清液以備用。另外，通過薄層層析初步鑒定產3-HP的菌株進行純培養，純化后的菌株接種于斜面培養基中保存。

1.2.2菌株的形態學觀察和生理生化試驗參考《微生物學實驗教程》和《微生物學實驗技術》等相關資料對產3-HP菌株進行形態學觀察和生理生化試驗。本研究所進行的生理生化試驗主要包括糖發酵試驗、淀粉水解試驗、脲酶測定、吲哚試驗、過氧化氫酶試驗、乙酰甲基甲醇試驗（VP試驗）以及甲基紅試驗（MR試驗）等。

1.2.3菌株的16S rDNA序列測定及系統發育樹構建菌株總DNA提取方法參考《精編分子生物學實驗指南》[13]。16S rDNA的PCR擴增條件如下：引物使用細菌通用引物（27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492 R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），20 μL的PCR擴增體系包括10×PCR buffer 2 μL、dNTP 0.8 μL、27 F和1492 R引物各 05 μL、模版DNA 1 μL、Taq酶0.3 μL、無菌水14.9 μL。PCR反應條件包括：94 ℃變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，進行30個循環；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，并將測得結果經由GenBank進行序列相似性搜索，然后采用Clustal X進行序列聯配分析，系統發育分析通過軟件MEGA 6.0完成。

1.2.4產物的薄層層析為初步確認所篩選的菌株是否產3-HP，通過薄層層析的方法進行檢測分析，參照李冰等方法[14]并稍作修改，展開劑由正丁醇、甲酸和水按照 19 ∶1 ∶10 的體積比所構成，顯色劑為0.1%溴甲酚綠，點樣體積為2 μL。

2結果與分析

2.1菌株的初步分離和形態觀察

將采集的樣品進行多輪分離，最終得到1株能夠在復篩培養基中生長良好菌株，將其命名Y31，劃線分離出單菌落后進行發酵驗證。從Y31菌落特征上看呈現乳白色、中間微凸起，48 h后呈淡黃色，不透明，直徑小于0.5 mm（圖1-A）。菌株Y31革蘭氏染色結果呈陽性，油鏡觀察到的顯微形態見圖1-B，單個細胞呈棒形球桿狀，兩端鈍圓，單個或成鏈狀排列。

2.2菌株的生理生化特性

2.2.1糖發酵測試通過一系列生理生化試驗指標對Y31菌株進行測定。結果表明，該菌可利用乳糖、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖且不產氣，能液化明膠，不能利用棉籽糖、甘露醇（表1）。

表1糖發酵測試結果

糖類結果乳糖+葡萄糖+麥芽糖+棉籽糖-鼠李糖+甘露醇-明膠+注：“+”表示能利用或能液化；“-”表示不能利用。

2.2.2其他方法測試淀粉水解試驗、吲哚試驗、乙酰甲基甲醇試驗呈現陰性；脲酶測定試驗、接觸酶試驗、甲基紅試驗為陽性（表2） 。生理生化測定結果結合形態學觀察，并對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版）發現Y31菌株與短桿菌相似。

表2其他方法測試結果

試驗結果淀粉水解-脲酶測定+吲哚-過氧化氫酶+VP-MR+注： “-”表示該試驗為陰性；“+”表示該試驗為陽性。

2.3菌株分子生物學鑒定

按照《精編分子生物學實驗指南》所述方法，提取Y31菌株的基因組DNA，然后利用細菌通用引物擴增該菌株的16S rDNA，經測序獲得該菌株16S rDNA序列，片段大小為 1 430 bp。選擇Genbank中與Y31菌株16S rDNA序列相似性較高的已知菌株的16S rDNA序列，并構建鄰接樹（N-J 法）。結果表明，菌株 Y31的16S rDNA序列與短乳桿菌具有較高的同源性，二者在以N-J 法構建的系統發育樹上聚為同一簇群（圖2），而通過生理生化試驗指標分析發現，該菌株能夠利用鼠李糖，不能夠利用棉籽糖，另外該菌株能夠在以丙酸為唯一碳源的培養基中生長，這與多數短乳桿菌有所不同，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版），初步鑒定菌株Y31為短乳桿菌變種，命名為Lactobacillus brevis Y31。

2.4發酵產物的鑒定

將發酵液離心后獲取發酵上清液，然后進行薄層層析分析，結果見圖3。通過測量點樣原點處到顯色斑點中心距離與原點至溶劑前沿距離，得出每個斑點的比移值Rf。計算得出發酵液和對照3-HP的Rf值接近，符合薄層層析定性要求，因此，初步確定Y31菌株所產的酸為3-HP。

3結論與討論

目前，化學法合成3-HP具有經濟可行的優勢，但從長久考慮，微生物法生產3-HP更加綠色環保。從相關文獻來看，微生物源3-HP的研究主要通過基因工程和代謝工程技術構建3-HP的生物合成途徑，并證實了某些微生物體內存在的3-HP代謝途徑[1，15]。相關試驗尚處于試驗階段，與生產應用還有一定距離。另外，從自然環境中分離的產3-HP菌株幾乎都面臨產物的毒性、耐受性問題，甚至構建的工程菌也存在相同的難題，有些基因工程菌還需依賴價格高昂輔酶B12[16]。

迄今已發現多種微生物能夠利用不同的碳源產生3-HP，本試驗從自然環境中分離出1種新發現的產3-HP菌株Y31，為該菌株的進一步選育創造了條件。通過形態觀察、生理生化試驗、分子生物學技術初步鑒定Y31菌株為短乳桿菌變種，為微生物源3-HP代謝網絡研究提供一定的技術參考。

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