2個(gè)淀粉含量不同木薯品種SSⅡ基因序列及不同生育期淀粉含量比較

曾文丹　羅興錄

摘要：以高淀粉木薯品種FX 01和低淀粉木薯品種sc 124為材料，探討可溶性淀粉合成酶基因SSⅡ序列以及在不同生育期其淀粉特性的差異。結(jié)果表明：在SSⅡ，，的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)差異位點(diǎn)，這2個(gè)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致了基因編碼的蛋白發(fā)生了改變，分別由谷氨酰胺變成精氨酸和亮氨酸變成苯丙氨酸。在淀粉積累的各個(gè)時(shí)期，高淀粉木薯品種FX 01的支鏈淀粉、直鏈淀粉、總淀粉含量均顯著高于低淀粉木薯品種SC124。

關(guān)鍵詞：木薯；可溶性淀粉合成酶；基因；淀粉

中圖分類(lèi)號(hào)：S533.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）05-0035-04

木薯（Manihot esculenta Crantz）別稱(chēng)樹(shù)薯、木番薯，是一種富含淀粉的塊根作物，因而有“淀粉之王”“地下糧倉(cāng)”等美稱(chēng)，與馬鈴薯、甘薯并稱(chēng)為世界三大薯類(lèi)作物。近年來(lái)，由于全球環(huán)境、糧食、能源危機(jī)的不斷加劇，新興綠色能源產(chǎn)業(yè)越來(lái)越受到人們的重視。木薯作為清潔、可再生的新興生物質(zhì)能源的代表，已成為中國(guó)綠色能源發(fā)展戰(zhàn)略的新焦點(diǎn)。木薯淀粉中直鏈淀粉約占17%，支鏈淀粉約占83%，而高比例的支鏈淀粉可轉(zhuǎn)變?yōu)樽冃缘矸郏巧a(chǎn)加工的重要原料。因此如何提高木薯支鏈淀粉的含量是研究的主要目標(biāo)之一。

已有研究表明，可溶性淀粉合成酶（SSS）在α-1，4-糖苷鍵的作用下，將ADPG中的葡萄糖加到側(cè)鏈的非還原端，使支鏈淀粉的分支鏈進(jìn)一步延伸和加長(zhǎng)，因此可溶性淀粉合成酶（sss）的主要作用是參與支鏈淀粉的合成。可溶性淀粉合成酶基因（SSⅡ）負(fù)責(zé)中等長(zhǎng)度支鏈淀粉的合成，該基因在淀粉構(gòu)成中發(fā)揮著重要作用，是支鏈淀粉積累過(guò)程中的關(guān)鍵因子。本試驗(yàn)中高淀粉木薯品種FX 0l是以低淀粉木薯品種SC 124為材料，經(jīng)過(guò)輻射誘變而獲得的高淀粉突變體。2個(gè)品種之間除塊根淀粉含量有較大差異外，其他農(nóng)藝性狀相似。本試驗(yàn)探討高低木薯淀粉品種SSⅡ，基因序列和淀粉特性的差異，以期為木薯支鏈淀粉生物合成和分子調(diào)控的機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為高淀粉木薯品種FX 01和低淀粉木薯品種SC 124，種植于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院科研教學(xué)基地。于2012年4月下種。2個(gè)品種設(shè)3次重復(fù)，隨機(jī)排列，田間管理與常規(guī)大田生產(chǎn)管理相同。

1.2取樣時(shí)間與方法

指標(biāo)采樣時(shí)間于木薯塊根形成期（下種后120d）、塊根膨大期（下種岳180d）、塊根成熟期（下種岳240d）、收獲期（下種后300d）采樣。采集鮮樣后，105℃殺青30min左右，75℃烘干至恒質(zhì)量后粉樣過(guò)篩。

1.3SSⅡ基因克隆

1.3.1RNA的提取參照參照潘華清等的異硫氰酸胍一過(guò)柱法略有修改。

1.3.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenkBank中木薯SSⅡ，基因（登錄號(hào)為EF667961.1）序列，設(shè)計(jì)引物。SSⅡ上游引物（p1）：5一ATGGCATTTATAGGATCACTTCCT-3；SSⅡ下游引物（p2）：5‘-TCACCACTGGTACTTGGCTGCA-3。

1.3.3 RT-PCR擴(kuò)增cDNA第一鏈的合成按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的操作說(shuō)明進(jìn)行，引物使用隨機(jī)引物olig（dT）18；PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1uL、p1和p2各1uL、2×Gold-Star Best Master Mix 10uL、加RNase free的ddH2O至20uL；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，35個(gè)循環(huán)；再在72℃下延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物加核苷染料后在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。用凝皎回收試劑盒回收目的條帶。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化

將回收的目的條帶與PUC-TA進(jìn)行連接載體。連接體系：回收產(chǎn)物1uL、PUC-T載體1uL、Solution Buffer 5uL、ddHzO 3uL。將上述組分振蕩混勻，22℃連接2h。將上述連接產(chǎn)物加入到50uL的大腸桿菌DH50z感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取菌液經(jīng)鑒定后送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.4淀粉含量的測(cè)定

淀粉含量測(cè)定參照何照范的雙波長(zhǎng)法。支鏈淀粉、直鏈淀粉含量測(cè)定的波長(zhǎng)參照閔義等的方法，直鏈淀粉含量測(cè)定波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為486nm；支鏈淀粉含量測(cè)定波長(zhǎng)為532nm，參比波長(zhǎng)為766nm。用UV-2501型紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0和Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.結(jié)果與分析

2.1總RNA的檢測(cè)

以木薯的葉、莖、根混合樣為材料提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖1），檢測(cè)RNA的質(zhì)量。本試驗(yàn)提取的總RNA的28S、18S條帶清楚完整，無(wú)拖尾，且28s條帶亮度大約是18s條帶的2倍，點(diǎn)樣孔及附近無(wú)亮斑，表明RNA完整性好，無(wú)蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)污染。核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA的純度和濃度，D260nm/D280nm的平均值為1.87，濃度為3100ng/uL。數(shù)據(jù)表明所提取的RNA純度較高，能夠滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，加引物p1、p2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，如圖2所示。PCR產(chǎn)物大小約為2 200bp，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期目的片段大小符合。

將擴(kuò)增獲得的SSⅡ基因與T載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。從轉(zhuǎn)化后的平板隨機(jī)挑選單菌落震蕩培養(yǎng)3～4 h后進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。如圖3、圖4所示菌液擴(kuò)增片段大小為2200bp，與RT-PCR結(jié)果一致，表明為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性菌液送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。

2.3 FX 01和SC 124中SSⅡ序列的差異分析

在引物和PCR條件不變的情況下，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠電泳結(jié)果顯示，從FX 01和SC 124中擴(kuò)增的條帶大小相同，表明SSII在FX 01和sc 124中大小相同。通過(guò)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在SSII的編碼區(qū)存在2個(gè)位點(diǎn)差異，分別在+272和+1800處，其中+272處SC 124為A，而FX 01則突變?yōu)镚；在+1800上，SC 124為G，而FX 01突變?yōu)門(mén)（圖5），這2個(gè)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致了基因編碼的蛋白也發(fā)生了改變，分別由谷氨酰胺變成精氨酸、由亮氨酸變成苯丙氨酸（圖6），蛋白由極性變成非極性。

2.4木薯塊根淀粉含量的變化

FX 01和SC 124直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量的變化均是隨著生育期的推移而不斷增加（表1）。整個(gè)生育期內(nèi)，F(xiàn)X 01塊根直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量均高于SC124。在木薯塊根形成期，高低木薯品種FX 01與SC 124塊根的直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量差異均不顯著，而在木薯的塊根快速膨大期、塊根成熟期及收獲期，F(xiàn)X 01塊根直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉含量均極顯著高于SC 124。

3.討論與結(jié)論

SS基因在支鏈淀粉合成中起著重要的作用，研究表明，如果SS基因發(fā)生突變或通過(guò)轉(zhuǎn)入反義SS基因，該基因的結(jié)構(gòu)將發(fā)生改變，從而引起可溶性淀粉合成酶的活性降低，最終導(dǎo)致支鏈淀粉含量也隨之變化。譚彩霞等通過(guò)RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)化馬鈴薯，其結(jié)果表明馬鈴薯中淀粉粒的結(jié)構(gòu)和形態(tài)也隨之發(fā)生了改變，與此同時(shí)馬鈴薯中SSN基因的表達(dá)量減少，從而使SSS酶活性也受到影響，最終造成直鏈淀粉含量上升而支鏈淀粉含量卻迅速下降。對(duì)擬南芥SSIV突變體的研究發(fā)現(xiàn)其淀粉含量有所減少但支鏈淀粉和直鏈淀粉的比例并未發(fā)生變化，鏈長(zhǎng)分布也未發(fā)生改變。王平榮等用EMS誘變獲得的突變體植株中，有3個(gè)突變體的OsDVR堿基突變位點(diǎn)和數(shù)目不同，從而導(dǎo)致編碼蛋白的氨基酸發(fā)生突變，造成了它們?cè)谌~綠素含量、葉綠素組成、植株表型以及主要農(nóng)藝性狀和單株產(chǎn)量極顯著差異。

本試驗(yàn)中，在SSⅡ的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)位點(diǎn)差異，在+272上，SC 124為A，而FX 01則突變?yōu)镚；在+1800上，SC124為G，而FX01突變?yōu)門(mén)，這2個(gè)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致了密碼子發(fā)生改變從而導(dǎo)致其編碼的氨基酸發(fā)生變化，分別由谷氨酰胺變成精氨酸、由亮氨酸變成苯丙氨酸，最終導(dǎo)致蛋白由極性變成非極性。這可能是導(dǎo)致從塊根形成期到收獲期，高淀粉木薯品種FX 01的支鏈淀粉、直鏈淀粉、總淀粉含量均顯著高于低淀粉品種SCl24的原因之一。至于其他淀粉合成關(guān)鍵酶基因有何變化還有待進(jìn)一步研究。