巴什拜羊BPI基因的克隆與真核表達

陳冬梅等

摘要：從巴什拜羊外周血多形核粒細胞（PMN）中提取總RNA，經RT-PCR擴增出巴什拜羊BPI基因片段，將其克隆至pPIC9K載體中，構建真核表達質粒pPIC9K-BPI，經PCR、酶切及測序鑒定正確后，電轉化至畢赤酵母GS115中并用甲醇誘導表達，SDS-PAGE鑒定重組BPI蛋白的表達，通過微量肉湯稀釋法檢測重組BPI蛋白的抑菌活性。結果表明：RT-PCR擴增獲得597 bp巴什拜羊BPI基因；經PCR、酶切及測序鑒定證實成功構建BPI基因的真核表達載體，SDS-PAGE檢測結果表明，重組BPI蛋白成功表達，通過抑菌試驗表明表達的重組BPI蛋白具有明顯抑菌活性。

關鍵詞：巴什拜羊；殺菌性；通透性增加蛋白；畢赤酵母；基因克隆；真核表達

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0039-04

收稿日期：2014-09-16

我國是養羊大國，新疆維吾爾自治區是我國主要的綿羊生產基地，巴什拜羊是新疆乃至國內外不可多見的綿羊地方優良品種，具有特殊的生物學特性[1]，原產自新疆維吾爾自治區裕民縣。該羊具有生長發育速度快、生產性能高、抗病力強等特征，其羔羊成活率達95%以上，是發展我國重要的羊品種資源[2]。殺菌性/通透性增加蛋白（BPI）主要存在于人、哺乳動物的多形核粒細胞（PMN）嗜天青顆粒中，是PMN的主要抗菌成分[3-5]，具有殺菌、中和內毒素以及促進補體活化增強調理功能的作用。Vander等發現，BPI蛋白可以誘導血管內皮細胞的凋亡，抑制血管生成，在體外血管生成試驗中，在1.8 μmol/L濃度下作用24 h后BPI蛋白能夠抑制81%的血管生成，這一發現使BPI蛋白有望用于治療癌癥或與血管形成有關的疾病[6]。BPI蛋白在抗真菌感染[7]、抗弓形蟲感染[8]等領域也有非常重要的意義。2005年，美國食品藥品管理局批準rBPI21/rBPI23進行Ⅱ～Ⅲ期臨床試驗，該臨床試驗主要研究兒童急性腦膜炎菌血癥、出血、腹腔感染、肝切除以及膽囊纖維化導致的嚴重感染，還有其他革蘭氏陰性菌、內毒素進入血液循環而造成的致病、致死等癥狀 [9]。Levy證實了rBPI21不僅可以降低病死率，顯著降低血液IL-6的水平，還可以減少感染性并發癥和成人呼吸窘迫綜合征的發生率[10]。周紅等從豬PMN 中提取了豬源BPI 蛋白，發現豬源性BPI 蛋白具有中和內毒素、殺滅革蘭氏陰性菌的作用[11] 。朱璟研究BPI基因對豬抗F18大腸桿菌感染的功能及機理[12]。2004年，Alexander等用腺病毒介導的BPI轉基因小鼠模型進行體內外試驗，均顯示腺病毒為載體的重組BPI介導的基因轉化可以進行細胞外分泌，且分泌的BPI蛋白可以中和脂多糖LPS，并且減少致炎細胞因子TNF-α和巨噬細胞炎癥蛋白-2（MIP-2）的產生[13]。但有關羊BPI基因的功能還未見報道。本試驗從巴什拜羊外周血中提取多形核粒細胞PMN總RNA，經RT-PCR獲得BPI目的基因片段，構建巴什拜羊BPI真核表達載體，并對其表達產物進行生物活性檢測，旨在為進一步深入研究巴什拜羊重組BPI蛋白的生物學功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗動物、菌株與載體

本試驗所用的5只巴什拜羊由石河子大學動物科技學院試驗站提供。巴斯德畢赤酵母GS115菌株及表達載體pPIC9K為新疆農墾科學院獸醫研究所薄新文研究員饋贈，DH5ɑ菌株由石河子大學動物科技學院生化實驗室保存。抑菌試驗所用的大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、沙門氏菌（Salmonella spp.）ATCC14028、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）ATCC25923均為石河子大學動物科技學院中獸醫實驗室饋贈。

1.2主要試劑

反轉錄試劑盒，限制性內切酶SnaBⅠ、NotⅠ、SacⅠ和Taq聚合酶均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自天根生化科技有限公司；蛋白marker購自Fermentas公司；酵母基因組DNA快速提取試劑盒、質粒小量提取制備試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA marker DL 2501、DNA Marker DL 2503購自上海捷瑞生物工程有限公司；D-山梨醇、酵母氮堿（YNB）、G418、生物素均購自北京索萊寶科技有限公司；普通肉湯培養基中的蛋白胨、酵母提取物購自上海坤肯生物化工有限公司；中性粒細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。

1.3目的片段的擴增及重組表達質粒pPIC9K-BPI的構建

巴什拜羊BPI基因cDNA全長序列由筆者所在實驗室通過cDNA末端快速擴增技術（RACE）獲得，登錄號為KF523344。根據該基因的ORF設計活性段表達引物，上游引物為5′-TACGTA ATGACCAACCCAGGCATCGTG-3′，下游引物為5′-GCGGCCGCTCATAGTTTGGTTGTCACTGGCAG-3′。通過頸靜脈采集巴什拜羊血液，用肝素抗凝，按照中性粒細胞分離液說明書方法分離外周血中性粒細胞。用Trizol法抽提巴什拜羊中性粒細胞總RNA。提取的總RNA用無菌DEPC水溶解，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以提取的PMN總RNA為模板，反轉錄合成cDNA，再以cDNA模板進行PCR擴增。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。用 NotⅠ、SnaBⅠ分別對巴什拜羊BPI基因及pPIC9K表達載體進行雙酶切，用T4 DNA連接酶在16 ℃連接過夜，將10 μL連接產物轉化于100 μL感受態細胞DH5α，涂布于含有 100 mg/L 氨芐青霉素的LB瓊脂板上，于37 ℃恒溫箱中靜止過夜培養。挑取單個菌落，接種于5 mL含有 100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃ 220 r/min振蕩過夜培養。取2～3 mL菌液，提取質粒，進行雙酶切、PCR鑒定，同時將 1 mL 菌液和5 μL質粒送往北京六合華大基因科技股份有限公司測序，將測序結果正確的重組質粒命名為pPIC9K-BPI。

1.4重組表達質粒pPIC9K-BPI的轉化與鑒定

按Riffault等的方法[14]制備感受態酵母菌GS115，取80 μL 感受態GS115與20 μL線性化的重組表達質粒pPIC9K-BPI混合，電擊轉化后涂布于MD平板上，28 ℃孵育3 d，每天觀察菌落的生長情況。挑取單菌落，用酵母基因組DNA快速提取試劑盒提取酵母基因組DNA，以其為模板，分別用表達引物和用酵母載體上的通用引物（α-Factor：5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′、3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）進行基因型、表型鑒定。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，根據擴增片段的大小判斷酵母染色體中是否有目的基因片段插入。基因型鑒定中PCR的反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，32個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。若能夠擴增出1條目的條帶，再進行表型鑒定，表型鑒定的反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，32個循環；72 ℃延伸 10 min，4 ℃ 保存。在表型鑒定中，若能擴增出2條帶，一條是含有目的基因片段的擴增條帶，另一條是野生型AOX1基因的擴增帶，約為 2.2 kb，則為陽性轉化子即Mut+（甲醇利用野生型）表型特征。

1.5重組菌株GS115/pPIC9K-BPI的表達與SDS-PAGE分析

將PCR鑒定正確的重組酵母菌GS115/pPIC9K-BPI接種于50 mL YPD培養基中，于28 ℃培養至D值為4時，6 000 r/min離心3 min，收集菌體。將富集的菌體轉接于250 mL BMMY培養基中繼續培養。每隔24 h加入終濃度為0.5%的甲醇誘導表達。同時按0、24、48、72、96、108 h分別取1 mL菌液樣品，離心收集上清、菌體，并將上清、菌體分別進行SDS-PAGE鑒定。

1.6抑菌試驗檢測表達產物的活性

1.6.1不同濃度的重組BPI蛋白對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用在配好的普通肉湯培養基中加入重組BPI蛋白，使其終濃度分別為5、10、20、40、80 μg/mL，將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌稀釋至濃度為0.01億CFU/mL，取30 μL接種于含有各種濃度重組蛋白的肉湯培養基中。另外在不含重組BPI蛋白的肉湯培養基中分別加入30 μL大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌作為陽性對照，不含細菌也不含有重組蛋白的普通肉湯培養基設為陰性對照。在96孔板中以微量稀釋法測定重組BPI蛋白的抑菌活性，37 ℃培養12 h后使用酶標儀在600 nm波長下進行觀察并記錄其D值[15]。重復3次，取平均值（下同）。

1.6.23個不同濃度重組BPI蛋白對大腸桿菌的抑制作用在普通肉湯培養基中加入重組BPI蛋白，使其終濃度為20、40、80 μg/mL，將30 μL大腸桿菌加入其中。陰性對照與陽性對照設置同上。37 ℃下分別培養1、2、3、4、5 h，設置酶標儀在600 nm波長下，對96孔板進行掃描，測定D值，保存數據。

1.7數據處理

數據以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 13.0軟件對所測數據進行Two-way ANOVA方差分析，比較重組BPI蛋白的抑菌效果。

2結果與分析

2.1RNA的完整性與純度

從巴什拜羊PMN中提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見明顯的28S、18S、5S條帶（圖1），說明提取總RNA基本沒有降解，具有較好的完整性。對其進行紫外分光光度分析得出D260 nm/D280 nm的值>1.8，表明RNA具有較高的純度，符合反轉錄要求。

2.2重組表達質粒pPIC9K-BPI的PCR與雙酶切鑒定

重組表達型質粒pPIC9K-BPI經Not、SnaBⅠ雙酶切和PCR鑒定，均得到了大小為597 bp的條帶，與預期片段大小相符合（圖2、圖3）。測序結果正確，表明目的片段已正確插入到真核表達載體中。

2.3重組菌株GS115/pPIC9K-BPI的PCR鑒定

挑取YPD-G418平板上的單個菌落，以重組菌株的

DNA為模板，分別進行基因型、表型鑒定。在基因型鑒定中可見陽性轉化子條帶大小為597 bp，與預期條帶大小相符合（圖4）。在表型鑒定中，用酵母通用引物進行PCR 擴增鑒定，可見陽性轉化子能擴增出2條帶，一條是含有目的基因片段的擴增條帶，約597 bp，另一條是野生型AOX1基因的擴增帶，約2.2 kb，為Mut+（甲醇利用野生型）表型PCR鑒定特征（圖5）。

2.4重組菌株GS115/pPIC9K-BPI表達產物的SDS-PAGE分析

將重組菌株GS115/pPIC9K-BPI經甲醇誘導表達后，分別收集上清、菌體，上清經過SDS-PAGE分析，在約43 ku處出現條帶，與預期目的蛋白分子量相符，在空載質粒對照組和0 h表達載體未見有條帶，表明BPI蛋白成功表達（圖6），收集的菌體沒有表達出目的蛋白。

2.5抑菌試驗檢測重組BPI的蛋白活性

表1表明，各試驗組細菌的陽性對照組（肉湯培養基中

分別加入大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）D值基本一致，陰性對照組（肉湯培養基）的D值也基本一致。當蛋白濃度為5、10 μg/mL時， 大腸桿菌組、沙門氏菌組與金黃色葡萄球菌組的D值差異不顯著。當蛋白濃度為20 μg/mL時，大腸桿菌組、沙門氏菌組的D值顯著低于金黃色葡萄球菌組。當蛋白濃度為40、80 μg/mL時，大腸桿菌、沙門氏菌組的D值極顯著低于金黃色葡萄球菌組。由此可見，重組BPI蛋白的濃度在20 μg/mL以上可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌的生長，對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。

3結論與討論

本試驗選用pPIC9K表達載體，并在巴斯德畢赤酵母表達系統進行表達。pPIC9K載體可以快速篩選高拷貝整合轉化子，并且具有來自轉座子Tn903的卡那霉素耐藥基因，能夠根據基因劑量效應，對G418的抗性水平快速篩選出高拷貝的轉化子，高拷貝整合的轉化子能夠提高外源基因的表達量[16]。本試驗中，筆者充分利用該載體的特性，先進行高拷貝整合的轉化子篩選，然后再進行表達，結果發現重組蛋白表達量高達28 mg/mL。巴斯德畢赤酵母作為真核表達系統，具有嚴格調控外源蛋白的表達、加工修飾表達產物、表達量高、營養要求低等優點。此外，巴斯德畢赤酵母中表達產物可分泌至胞外，有利于表達產物的分離純化[17]。本試驗選用pPIC9K表達載體，構建pPIC9K-BPI表達質粒，并在巴斯德畢赤酵母表達系統進行表達，結果表明，用此技術表達重組蛋白高效、穩定、表達產物易于純化。天然BPI蛋白由456個氨基酸殘基組成的堿性蛋白，含N端、C端、中間連接單位3部分組成，經蛋白酶水解后可裂解為N端片段、C端片段，N端功能片段具有天然BPI的完整殺菌、中和細菌脂多糖（LPS）等活性[18]。目前有2種BPI蛋白獲取方法，但使用柱層析法獲得的BPI蛋白工作量大，獲取量低，成本高。而Gazzno-Santoro等用逆轉錄PCR的方法獲得分子量為23 ku的重組蛋白rBPI23，由于具有較高的活性，且容易獲取，廣泛應用于臨床試驗，將人的BPI N-末端的 cDNA 擴增轉入細胞載體后通過田倉鼠卵細胞中表達重組蛋白[19]。由于目前國內外采用基因工程方法在豬、鼠、兔和牛上都獲得了重組BPI蛋白。在此之前，筆者所在實驗室通過RACE技術獲得了巴什拜羊BPI基因全長cDNA序列（GenBank登錄號為KF523344），本試驗根據此序列設計特異性引物進行PCR擴增，克隆出巴什拜羊BPI N-端序列，并在巴斯德畢赤酵母中成功表達出43 ku的含有199個氨基酸的重組BPI蛋白，經過抑菌試驗檢測該重組蛋白具有明顯的抑菌活性，為研究綿羊BPI蛋白的其他生物學功能奠定基礎。PMN細胞內諸多抗菌成分中，BPI是唯一能夠直接對革蘭氏陰性菌發揮殺菌作用和中和內毒素作用的抗菌物質，被譽為“超級抗生素”[20]。本試驗中巴什拜羊重組BPI蛋白對G-菌均具有殺菌活性，但對G+無明顯效果。研究發現，BPI的N端、C端均含有1個非極性的脂質結合口袋，該非極性口袋為BPI與LPS相互作用的位點。BPI分子N端的堿性氨基酸殘基比酸性氨基酸殘基多16個，而C端的堿性氨基酸殘基比酸性氨基酸殘基少2個。BPI蛋白分子N端和C端電荷的不對稱分布促使的帶正電荷的N端更加能夠促進BPI分子與G-菌細胞壁上帶負電荷的LPS之間的結合而起殺菌作用[21]。

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