木香超臨界提取物的安全性及功能性研究

張 琨 高 峰 孟令儀 宋昕恬 吳曉剛 張晶瑩

（吉林省疾病預防控制中心，吉林 長春 130062）

木香超臨界提取物的安全性及功能性研究

張 琨 高 峰 孟令儀 宋昕恬 吳曉剛 張晶瑩

（吉林省疾病預防控制中心，吉林 長春 130062）

目的 研究一種含木香超臨界提取物軟膠囊的安全性及對胃黏膜損傷保護作用。方法 采用MTD法以20 g/kg BW進行小鼠急性毒性試驗；以10、5、2.5 g/kg BW三個劑量進行小鼠骨髓微核及精子畸形試驗；以5000、1000、200、40、8微克/皿5個劑量進行Ames試驗；以0.83、0.625、0.417 g/kg BW三個劑量進行30 d喂養試驗；以0.25、0.08、0.04 g/kg BW三個劑量進行胃黏膜損傷保護性研究。結果 該軟膠囊雌、雄性小鼠MTD＞20.0 g/kg BW，屬無毒級；小鼠骨髓細胞微核試驗、精子畸形試驗及Ames試驗結果均為陰性，無致突變性；30 d喂養試驗未見任何異常表現；0.25，0.08 g/kg BW兩個劑量組大鼠與模型對照組比較胃黏膜損傷面積明顯降低（P＜0.01），損傷抑制率明顯增加（P＜0.01）。結論 該軟膠囊未見毒性，且在一定劑量范圍內對胃黏膜損傷有保護作用。

木香超臨界提取物；安全性；胃黏膜損傷；保護作用

木香系菊科植物木香的干燥根，具有行氣止痛、消食健脾之功效，是治療胃腸疾病的常用藥［1］。而超臨界二氧化碳萃取具有常溫、無毒、使用安全簡便、時間短、產品質量高等特點，能有效提取木香中的活性成分木香烴內酯、去氫木香內酯，且其總量＞50%，該活性成分具有松弛平滑肌、解痙、抗菌以及降壓作用［2］。木香的安全性方面我們查閱了文獻：大鼠的腹腔注射LD50總內酯為300 mg/kg，二氫木香內酯200 mg/kg。總生物堿小鼠靜脈注射的最大耐受量為100 mg/kg，大鼠為90 mg/kg。木香揮發油混入大鼠飼料中，每日服量為1.77 mg/kg（雄性）與2.17 mg/kg（雌性），連續給藥90 d對大鼠的生長、血常規與血尿素氮均無影響，主要臟器的病理檢查亦未見異常［3］。基于以上資料，本文對新研制的保健食品進行了毒性及功能性評價。

1　材料與方法

1.1樣品：該提取物軟膠囊內容物為6000 g木香采用超臨界二氧化碳法萃取出的提取油加橄欖油混合至1000 g（經測定每100 g成品含木香烴內酯、去氫木香內酯4 g），樣品為油狀液體，動物實驗各劑量樣品用大豆油配制。

1.2試驗動物：SPF級動物Wistar大白鼠及ICR小白鼠由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供，批準證號：SCXK-（吉）2011-0004。飼養條件：實驗動物環境設施合格證，吉動設字10-1005，實驗動物使用許可證號：SYXK-（吉）2010-0011；溫度20～22 ℃、濕度55%～65%；飼料由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，合格證號：SCXK-（吉）2010-0001。

1.3主要儀器和試劑：德國Sartorius-BL610電子天平，美國ELECTRONIC SCALET1000電子天平，日本Olympus-CH顯微鏡，日本SYSMEX-XT1800i血球分析儀，日本東芝TBA-120FR全自動生化分析儀，Leica病理制片系統等；環磷酰胺，血液學指標及血生化試劑盒，無水乙醇，甲醛等。

1.4試驗方法

1.4.1急性毒性試驗［4］采用最大耐受劑量（MTD）法，設20 g/kg BW一個劑量組。雌、雄小鼠各10只（體質量18～22 g）禁食16 h，不限飲水，經口灌胃給予樣品觀察14 d（中樞神經系統及軀體運動有無改變姿勢、叫聲異常、運動失調等；有無瞳孔放大或縮小、流淚等；有無流鼻涕、潮式呼吸等；胃腸有無氣脹，腹瀉或便秘等），記錄出現中毒癥狀及死亡數和時間。對死亡動物做大體解剖。

1.4.2微核試驗［4］設10、5、2.5 g/kg BW三個劑量組，另設陰性對照組（大豆油）、陽性對照組（環磷酰胺40 mg/kg BW），采用間隔24 h兩次經口灌胃法，雌、雄小鼠各25只（體質量25～30 g），隨機分組，灌胃量為0.2 mL/10g BW。第二次灌胃后6 h，頸椎脫臼處死小鼠，取股骨以小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。光鏡下，每只動物計數1000個嗜多染紅細胞，數據進行統計分析。

1.4.3精子畸形試驗［4］劑量組及對照組設置及灌胃量同微核試驗，雄性小鼠25只（體質量25～30 g），隨機分組，每日灌胃一次，連續5 d。在第30天完成最后一次灌胃后將小鼠處死，取附睪制片，伊紅染色，每只動物計數1000個結構完整的精子，計算畸變精子發生率并進行統計分析。

1.4.4Ames試驗［4］設5000、1000、200、40、8微克/皿5個劑量，二甲基亞砜作為溶劑，受試液經滅菌（時間20 min，溫度：121 ℃，壓力：0.103 Mpa）后使用；另設未處理對照、溶劑對照、陽性對照。測試菌株采用鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。測試菌液濃度每毫升不少于1×109活菌數。陽性對照：非活化系統TA97、TA98、TA102為敵克松50.0微克/皿，TA100為疊氮鈉1.5微克/皿。活化系統TA97、TA98、TA100采用二氨基芴10.0微克/皿，TA102為1，8-二羥基蒽醌50.0微克/皿。采用平板摻入法計數每皿回變菌落數。樣品的回變菌落數是自發回變菌落數2倍以上，并具有劑量-反應關系者則視為陽性。每個劑量做三個平行。整套試驗在相同條件下重復做2次并分別統計。

表1　樣品對胃黏膜損傷積分及改善程度比較

圖1　樣品對乙醇急性胃黏膜損傷的保護作用

1.4.530 d喂養試驗［4］分為溶劑對照組及三個劑量組（0.83、0.625、0.417 g/kg BW），每組雌雄各10只。灌胃量1 mL/100g BW。單籠喂養，自由飲食，記錄大鼠每周進食量、體質量，連續觀察30 d。包括一般情況觀察（動物的一般表現行為、中毒癥狀及死亡情況，計算周食物利用率及總食物利用率）；檢測血液學指標（血紅蛋白、紅細胞、血小板、白細胞分類）及血液生化指標；病理檢查包括大體解剖、臟器絕對重量和相對重量（臟/體比值）、組織病理檢查。

1.4.6對胃黏膜損傷有輔助保護功能試驗［5］設0.25、0.08、0.04 g/kg BW三個劑量組及模型對照組（給予大豆油），灌胃量1 mL/100g BW，每周稱重調整灌胃量。各組灌胃30 d后，全部動物嚴格禁食24 h（不禁水）各組動物灌胃給予無水乙醇1毫升/只，1 h之后處死動物，將胃完全暴露，結扎幽門，灌注適量10%甲醛溶液，固定20 min，然后沿胃大彎剪開，把胃內容物清洗干凈，將胃黏膜展開，在體視解剖顯微鏡下或肉眼下用游標卡尺測量出血點或彌漫性出血帶的長度和寬度，因寬度所代表損傷的嚴重性遠較長度大，故雙倍積分。大體檢查完畢，將每只動物胃黏膜損傷最嚴重的部位切下，固定于10%甲醛溶液，制常規片，HE染色，鏡下觀察。以充血、出血、黏膜細胞變性壞死在整個黏膜上皮層的累及程度分為5級。充血權重為1，出血權重為2，上皮細胞變性壞死權重為3。測量及鏡檢后參照標準進行評分。

1.5結果判定：數據的統計處理采用SPSS11.5統計軟件中單因素方差分析進行均值比較，率的比較采用卡方檢驗。認為P＜0.05差異有統計學意義。

2　結 果

2.1急性毒性試驗：各組動物未見中毒癥狀、死亡數為零。雌、雄性小鼠：MTD＞20 g/kg BW。根據急性毒性半數致死劑量分級，屬無毒級。

2.2微核試驗：與陰性對照組比較，陽性對照組微核率有高度顯著性差異（P＜0.01），各劑量組微核率無顯著性差異（P＞0.05）；經方差分析，各組動物PCE/NCE值無顯著性差異（P＞0.05）。骨髓細胞微核試驗結果陰性，未見細胞毒性作用。

2.3精子畸形試驗：與陰性對照組比較， 陽性對照組精子畸形率有高度顯著性差異（P＜0.01），各劑量組精子畸形率無顯著性差異（P＞0.05）。結果為陰性。

2.4Ames試驗：加與不加S9結果均為陰性，即未見致突變作用。

2.5對胃黏膜損傷有輔助保護功能試驗：給予樣品30 d，所有大鼠生長、活動無出現異常情況。給予無水乙醇后損傷發生率均為100%，但0.25，0.08 g/kg BW兩個劑量組大鼠胃黏膜損傷面積明顯少于模型對照組（P＜0.01），損傷抑制率有明顯增加（P＜0.01），呈現劑量反應關系，證實該樣品對乙醇急性胃黏膜損傷具有保護作用（表1及圖1）。

3　討 論

本文對新研制的保健食品——含橄欖油的木香提取物軟膠囊進行了二階段毒性試驗，在確保其安全性基礎上，得出0.25，0.08 g/kg BW兩個劑量具有對胃黏膜損傷有輔助保護作用的結論。分析其機制與該軟膠囊內含有的木香超臨界二氧化碳法萃取油（木香烴內酯和去氫木香內酯）的主要作用相關，此前已有過報道［6］通過正常小鼠及利血平脾虛小鼠的胃排空和小腸炭末推進測定，發現不同劑量的木香烴內酯和去氫木香內酯，胃排空都有明顯改善，加快胃的排空可以減少乙醇在胃內的停留繼而輔助保護胃黏膜，減輕乙醇急性損傷對胃黏膜造成的損害。另外，侯鵬飛等［7］首次發現木香揮發油及去氫木香內酯、木香烴內酯具有抑制二磷酸腺苷誘導的血小板聚集活性。而邵蕓等采用小鼠耳廓、足跖炎性腫脹程度測定和大鼠膽汁排泄量測定表明［8］木香醇提取物其具有較好的抗炎、利膽作用，這些也都是該軟膠囊輔助改善乙醇產生的急性胃黏膜損傷保護作用的機制所在。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學工業出版社，2005：41-42.

［2］陳虹，鄧修.木香揮發油的超臨界CO2萃取及質量研究［J］.中草藥，1997，28（6）：337.

［3］苗明三，朱飛朋.實用中藥毒理學［M］.上海：第二軍醫大學出版社，2007：379.

［4］中華人民共和國衛生部.保健食品檢驗與評價技術規范（2003版）［S］.

［5］國食藥監保化［2012］107號附件2［S］.

［6］侯影，張旭.木香生品、麩煨品及活性單體對小鼠胃腸運動的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，24（17）：132-135.

［7］侯鵬飛，陳文星.木香揮發性成分氣質聯用分析及其抑制血小板聚集作用的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2008，7（14）：26-30.

［8］邵蕓，黃芳.木香醇提取物的抗炎利膽作用［J］.江蘇藥學與臨床研究，2005，4（13）：5-6.

Study on the Safety and Functionality of Supercritical Extract of Aucklandia

ZHANG Kun， GAO Feng， MENG Ling-yi， SONG Xin-tian， WU Xiao-gang， ZHANG Jing-ying
（Jilin Province CDC， Changchun 130062， China）

Objective To study the safety and protective effect to gastric mucosal damage of soft capsule including supercritical extract of Aucklandia. Methods Use the way of maximum tolerated dose 20 g/kg BW to do the acute toxicity test with mice； Use the dose of 10， 5， 2.5 g/kg BW to do marrow micronucleus and teratospermia test with mice； Use the dose of 5000， 1000， 200， 40， 8 μg/dish to do the Ames test. Use the dose of 0.83， 0.625， 0.417 g/kg BW to do the 30 days feed test with rat； Use the dose of 0.25， 0.08， 0.04 g/kg BW to study protective effect after gastric mucosal damage with rat. Result The MTD of this soft capsule is over 20 g/kg BW， it is in non-toxic level. We get the negative result in marrow micronucleus and teratospermia test and Ames test， it means non-mutagenicity. Abnormal phenomenon were not be seen in the 30 days feed test. In the test of protective effect after gastric mucosal damage with rat， we can see obvious reduce of gastric mucosal damage area and marked increase of damage inhibition ratio with the dose of 0.25， 0.08 g/kg BW compared with modelcontrol group. Conclusion This kind of soft capsule is safe and can protect the gastric mucosal damage with some range of dose.

Supercritical extract of Aucklandia； Safety； Gastric mucosal damage； Protective effect

R9

B

1671-8194（2015）012-0027-02