板栗殼中多酚的提取純化及其抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

劉　莉，唐新玥，張欣珂，王珺璟，歐陽杰，*（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京100083；2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京林業(yè)大學(xué)），北京100083）

板栗殼中多酚的提取純化及其抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

劉莉1，2，唐新玥1，2，張欣珂1，2，王珺璟1，2，歐陽杰1，2，*
（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京100083；2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京林業(yè)大學(xué)），北京100083）

以板栗殼為原料，經(jīng)回流提取、濃縮、萃取和大孔樹脂吸附洗脫，提取純化多酚并研究其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線表明，AB-8對(duì)板栗殼中多酚的吸附效果明顯，達(dá)到了4.41mg/g。靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)解吸的效果最好，能達(dá)到95%以上；而pH對(duì)解吸的效果影響不大。由動(dòng)態(tài)解吸曲線得到流速對(duì)解吸的效果影響較小。多酚洗脫曲線和對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率曲線的峰值重疊性較好，說明多酚能有效抑制該酶的活性，抑制率最大達(dá)到21.78%。

板栗殼，多酚，α-葡萄糖苷酶，抑制

板栗殼為殼斗科植物栗（Castanea mollissima Bl）的外果皮，其藥理作用主要有抗菌、抗炎、抗凝血、治療慢性支氣管炎和治療菌痢等。板栗殼中含有酚類、有機(jī)酸、糖、多糖、黃酮、植物甾醇和鞣質(zhì)等化學(xué)成分［1］。其中，板栗殼中的黃酮具有很好的抑菌效果，多酚具有較高的抗氧化能力［2-5］。

α-葡萄糖苷酶存在于人體腸道，能將食物中的碳水化合物降解為單糖，從而加速機(jī)體對(duì)糖的吸收，顯著提升人餐后的血糖含量，因此它與糖尿病和肥胖癥緊密相連。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過競爭性抑制小腸粘膜上皮細(xì)胞的α-葡萄糖苷酶，延緩腸道對(duì)碳水化合物的吸收，減緩餐后血糖升高而達(dá)到對(duì)糖尿病的治療［6-7］。目前已研發(fā)出以α-葡萄糖苷酶抑制劑為基礎(chǔ)的藥物有Acarbose和M iglitol等，多種中藥提取物也表現(xiàn)出對(duì)α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用［8］。有研究指出多酚類物質(zhì)能有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性［9］，但關(guān)于從板栗殼中分離出具有抑制α-葡萄糖苷酶活性物質(zhì)的研究報(bào)道較少。本文以板栗殼為原料，經(jīng)過回流提取、濃縮、萃取和大孔樹脂吸附洗脫，提取對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用的多酚，為板栗殼的進(jìn)一步加工利用和相關(guān)抗糖尿病功能食品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

板栗殼河北遷西板栗，品種為早豐；福林酚試劑、α-葡萄糖苷酶（30000U/g） 北京化學(xué)試劑公司；沒食子酸、無水乙醇、石油醚（60～90℃）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純，北京化學(xué)試劑公司；對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）、AB-8北京化學(xué)試劑公司。

Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司；POWERDRY LL1500真空冷凍干燥箱深圳市三諾儀器儀表有限公司；Bio-Rad 680酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司；752紫外可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司；HC-0110-02 10mm×200mm普通層析柱上海錦華層析設(shè)備廠。

1.2測定方法

1.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定方法以PNPG水解產(chǎn)生PNP的量作為α-1，4-葡萄糖苷酶活性大小的判定標(biāo)準(zhǔn)。測定時(shí)，取40μL 120U/m L的α-葡萄糖苷酶溶液和10μL洗脫后的樣品預(yù)混，在37℃下預(yù)混10m in。后加入20μL 10mmol/L的PNPG開始反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)在37℃的恒溫中持續(xù)30m in。之后加入100μL的0.1mol/L Na2CO3終止液，5min后于波長405nm處測定吸光度值。酶活力單位定義為在37℃、pH6.8條件下，1m in內(nèi)水解PNPG釋放1μmol對(duì)硝基酚（PNP）所需的酶量［10］。抑制劑活力單位定義為在相同條件下降低1個(gè)酶活力單位所需的抑制劑量。抑制率（%）=［（A-B）-（C-D）］/［A-B］×100，式中，A為未加提取物樣品的加酶混合液所測的吸光度；B為未加提取物樣品亦未加酶的混合液所測的吸光度；C為加提取物樣品和酶的混合液所測的吸光度；D為加提取物樣品而未加酶的混合液所測的吸光度。

1.2.2多酚的測定方法取2mg沒食子酸加水定容于100m L，得0.02mg/m L溶液，分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L于試管中，加入0.5m L福林酚，1.5m L 1.89mol/L的Na2CO3，定容至10m L，混勻后于75℃反應(yīng)10min，冷卻后于760nm處測吸光度值。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線［11］。線性回歸后得方程：y=84.643x-0.04，R2= 0.9978，線性范圍為0～0.015mg/m L。取待測液按上述方法測吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出待測液中多酚的濃度。

1.3板栗殼多酚粗提物的制備方法

將板栗殼洗凈、烘干后粉碎，按料液比1∶12（W/V）加75%乙醇回流提取4h，減壓過濾后得到板栗殼提取液。減壓濃縮得到浸膏，加水定容后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進(jìn)行萃取［12］。萃取完后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分別濃縮各萃取部分，冷凍干燥成粉末后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4大孔吸附樹脂分離純化多酚物質(zhì)

1.4.1樹脂預(yù)處理將AB-8［13］和D101［14］樹脂用無水乙醇浸泡24h后，用蒸餾水洗至無醇味。用1.0mol/L HCl浸泡3h后用蒸餾水洗至中性，再用0.5mol/L NaOH浸泡3h，用蒸餾水洗至中性。

1.4.2靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

1.4.2.1AB-8和D101樹脂對(duì)多酚的最大吸附量取AB-8和D101樹脂各1g于錐形瓶中，加入50m L 0.46mg/m L的樣品液進(jìn)行吸附；間隔一定時(shí)間取0.5m L樣品溶液進(jìn)行多酚含量的測定，可得到吸附多酚的最大吸附量。

1.4.2.2洗脫液濃度對(duì)解吸率的影響取AB-8樹脂1g于錐形瓶中，加入50m L 0.46mg/m L的樣品液進(jìn)行吸附。吸附6h后取出0.5m L測定多酚的含量。減壓抽濾后將吸附好的樹脂放入錐形瓶中，分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇25m L進(jìn)行靜態(tài)解吸。1h后取出0.5m L進(jìn)行多酚含量的測定，得到不同濃度洗脫液的解吸率。

1.4.2.3洗脫液pH對(duì)解吸率的影響取AB-8樹脂1g于錐形瓶中，加入50m L 0.46mg/m L的樣品液進(jìn)行吸附。吸附6h后取出0.5m L測定多酚的含量。減壓抽濾后將吸附好的樹脂放入錐形瓶中，分別用pH為3、4、5、6、7、8的60%乙醇溶液25m L進(jìn)行靜態(tài)解吸，1h后取出0.5m L進(jìn)行多酚含量的測定，得到不同pH洗脫液的解吸率。

1.4.3洗脫液流速對(duì)動(dòng)態(tài)洗脫的影響將預(yù)處理好的AB-8樹脂加適量蒸餾水浸泡后進(jìn)行濕法裝柱，裝柱完后分別用4BV的去離子水和3BV 10%的乙醇沖洗，洗去雜質(zhì)，靜置30min。分別用濃度為1mg/m L的樣品溶液13m L進(jìn)行上樣，上樣完畢后靜置30m in。分別用60%的乙醇以1、2、3BV/h的流速進(jìn)行洗脫，每2m L接一管，測定多酚的含量，繪制不同流速洗脫液的動(dòng)態(tài)洗脫曲線。

1.4.4多酚的洗脫曲線和對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲線根據(jù)優(yōu)化后的條件，將板栗殼提取液的水飽和正丁醇部分在AB-8樹脂上樣，用60%的乙醇以3BV/h的流速進(jìn)行洗脫，每4m L接一管，測定多酚的含量以及對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果與討論

2.1板栗殼多酚粗提物的制備

板栗殼用75%乙醇回流提取后的提取液中多酚含量為0.054g/g。將所得浸膏分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，將收集的萃取液脫去溶劑后，再分別進(jìn)行多酚含量測定。結(jié)果顯示，石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取部分多酚含量都為0，而水飽和正丁醇萃取部分多酚含量為0.292g/g，因此用正丁醇萃取部分用于大孔樹脂的分離純化。

2.2大孔吸附樹脂對(duì)板栗殼多酚粗提物的分離純化

將水飽和正丁醇部分的萃取液用乙醇配制成0.46mg/m L，進(jìn)行大孔吸附樹脂的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。

2.2.1大孔吸附樹脂對(duì)板栗提取物中多酚的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)大孔吸附樹脂D101和AB-8對(duì)多酚均有較好的吸附效果，兩種樹脂在5h內(nèi)基本吸附飽和。樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線顯示，AB-8樹脂對(duì)多酚的飽和吸附量是4.41mg/g，D101樹脂對(duì)多酚飽和吸附量為3.58mg/g。在有關(guān)對(duì)板栗苞多酚的吸附實(shí)驗(yàn)中，AB-8樹脂的效果也較好［15］。

圖1　大孔吸附樹脂對(duì)多酚靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1　The adsorptive kinetics curves of polyphenols of macroporous resin

2.2.2解吸液乙醇濃度對(duì)靜態(tài)吸附的影響如圖2所示，當(dāng)乙醇濃度分別為60%、70%、80%時(shí)，它們之間的解吸效果沒有顯著性差異（p＞0.05），但均顯著高于50%乙醇解吸液（p＜0.05），為節(jié)約成本，選取60%的乙醇用于AB-8樹脂的動(dòng)態(tài)洗脫。石恩慧等研究發(fā)現(xiàn)，從板栗總苞中提取純化多酚用70%乙醇解吸液效果最優(yōu)［16］，和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近。

圖2　解吸液乙醇濃度對(duì)解吸的影響Fig.2　The influence of ethanol concentration on the desorption rate

圖3　pH對(duì)解吸的影響Fig.3　The influence of pH on the desorption rate

2.2.3解吸液pH對(duì)靜態(tài)吸附的影響從圖3可知，pH 3～8之間的解吸液的解吸效果不存在顯著性差異（p＞0.05），解吸液的pH對(duì)靜態(tài)吸附的影響較小。板栗殼中多酚多為黃酮類，黃酮類屬于中性酚類［17］，其溶解度和化學(xué)性質(zhì)受pH的影響小，因此在不同pH的溶液中吸附作用波動(dòng)不大。

2.2.4流速對(duì)動(dòng)態(tài)洗脫影響從圖4可以看出，在多酚的洗脫中，隨著流速的增加，洗脫的峰形無太大變化，且都無滯后，無拖尾現(xiàn)象，說明流速對(duì)實(shí)驗(yàn)洗脫效果沒有太大影響。因此，選取3BV/h的流速來進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫。

圖4　多酚動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)Fig.4　Dynamic desorption curves of polyphenols

2.3大孔樹脂分離純化多酚及α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

按照上述優(yōu)化條件用AB-8樹脂進(jìn)行多酚的吸附洗脫，每4m L/管收集洗脫液，并對(duì)多酚含量和對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖5所示。多酚洗脫峰和抑制率的峰值重疊性較好，洗脫液體積16、20m L處多酚的含量分別為0.063、0.036mg/m L，抑制率分別為20.59%、21.78%，說明多酚能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性。多酚的降血糖作用也在其他天然提取物如茶葉中得到證實(shí)［18］。

圖5　洗脫液多酚含量及其抑制率Fig.5　The concentration of polyphenols and inhibition rate in eluent

3　結(jié)論

板栗殼乙醇提取液中多酚含量為0.054g/g，正丁醇萃取部分多酚含量為0.292g/g。采用大孔吸附樹脂AB-8對(duì)提取物進(jìn)行分離純化，乙醇濃度對(duì)解吸影響較大，60%（v/v）的乙醇溶液解吸效果較好；而洗脫液pH和洗脫流速對(duì)解吸影響不大。洗脫液中，多酚類物質(zhì)和抑制率的峰值部分重疊性較好，說明多酚是有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性的成分。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行板栗殼中多酚的放大洗脫、分離純化、多酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析和對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制機(jī)理等進(jìn)行研究。

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Extraction of polyphenols from chestnut shelland the bioactivity of inhibitingα-glycosidase

LIU Li1，2，TANG Xin-yue1，2，ZHANG Xin-ke1，2，WANG Jun-jing1，2，OUYANG Jie1，2，*
（1.Departmentof Food Science and Engineering，College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Polyphenols were extrac ted and purified by boiling reflux，vacuum concentration，liquid-liquid extraction and macroporous adsorp tive resin elution from Chinese chestnut shells，and the inhibiting effect onαg lycosidase was investigated.The static adsorp tion kinetic curves showed that AB-8 had good adsorp tion on polyphenols w ith the capacity of 4.41mg/g.The desorp tion rate reached above 95%w ith 60%（v/v）ethanol as eluent.The eluent pH and flow rate had low effects on the desorp tion rate.There was good overlap between elution curve of polyphenols and inhibition rate，which indicated that polyphenols could inhibit the ac tivity of α-g lycosidase effectively，and themaximal inhibition rate reached 21.78%.

chestnut shell；polyphenol；α-g lycosidase；inhibition

TS209

B

1002-0306（2015）06-0265-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.050

2014-07-02

劉莉（1991-），女，大學(xué)本科，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

歐陽杰（1971-），男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201204401）；2012年北京市大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（121002221）。