響應面法優化水飛薊莖中總黃酮的提取工藝

于金躍，孫　晶，李新華，齊曉軍，王海娜

（沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110161）

響應面法優化水飛薊莖中總黃酮的提取工藝

于金躍，孫晶，李新華*，齊曉軍，王海娜

（沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110161）

利用響應面法優化水飛薊莖中黃酮類物質的提取工藝。分別研究提取時間、乙醇體積分數、料液比、提取溫度四個單因素實驗對水飛薊莖中總黃酮提取量的影響。實驗結果表明，最佳提取工藝為提取時間50min、提取溫度61℃、乙醇體積分數40%、料液比1∶40。該條件下水飛薊莖中總黃酮提取量為4.71mg/g，與多項式回歸模型的結果一致。

水飛薊莖，總黃酮，響應面法，提取工藝

黃酮類化合物是植物產生的一些次級代謝產物［1］，廣泛存在于高等植物的根、莖、葉、花、果實等中。黃酮類化合物具有高度的化學反應性，如能清除體內的自由基，具有抗氧化性作用［2］；且黃酮類化合物擁有抑制酶的活性、抗病毒［3］、抗炎癥［4］、抗癌［5］、抗糖尿病并發癥［6］等功能，已被列為保健食品的一類功能因子［7］。

水飛薊（Silybum marianum）是一種一年生或兩年生植物，原產于南歐及北非［8］，被稱為具有抗癌活性的草藥［9］，同時有益于肝臟疾病［10］和免疫系統疾病的治療［11］。目前，水飛薊已成為世界公認的保肝植物。但目前大多是對水飛薊種籽進行研究，而對水飛薊莖葉的研究相對較少［12］。本研究以水飛薊莖為原料，采用有機溶劑提取水飛薊莖中黃酮類物質，以總黃酮提取量為指標，采用響應面法優化水飛薊莖中黃酮類物質的提取工藝條件，為進一步開發利用水飛薊莖葉提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

水飛薊莖采自遼寧盤錦，自然風干；蘆丁標準品（＞98%） 成都曼斯特有限公司；無水乙醇沈陽化學試劑廠。

GD200-2型電子天平北京賽多利斯儀器有限公司；KQ-250DB型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SHE-IIIB型循環水式多用真空泵上海博通經貿有限公司；7200型可見分光光度計尤尼柯（上海）有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1蘆丁標準曲線的繪制精確稱取蘆丁標準品10mg，用60%的乙醇定容至100m L的容量瓶中，配制成0.1mg/m L的標準液。

分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5m L的蘆丁標準品溶液于10m L試管中，加60%的乙醇溶液至5m L。加5%的NaNO2溶液0.3m L，搖勻后靜置5m in；加10%的A l（NO3）3溶液0.3m L，搖勻后靜置6m in；加4%的NaOH溶液4m L，用60%的乙醇溶液定容至10m L，搖勻后靜置15m in，于506nm處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，蘆丁質量濃度（mg/m L）為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線［13］。

1.2.2水飛薊莖中總黃酮含量的測定方法將風干的水飛薊莖打碎成粉末，過60目篩，準確稱取1.00g水飛薊莖粉末于錐形瓶中，在一定的溫度、料液比、乙醇體積分數下提取一定時間后，抽濾；濾液用乙醇溶液定容至100m L的容量瓶中，搖勻，作為待測液；移取1.00m L待測液按1.2.1方法于506nm處測定吸光度。根據回歸方程，用吸光度計算出被測液中黃酮類物質的質量濃度c，然后由c計算出水飛薊莖中總黃酮的含量。

式中：c-稀釋后樣品溶液總黃酮質量濃度（mg/ m L）；N-稀釋倍數：10；V-最初樣品定容體積（100m L）；m-樣品質量（1.00g）。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1提取溫度對總黃酮提取量的影響準確稱取1.00g的水飛薊莖粉5份，分別置于錐形瓶中，料液比為1∶40，用體積分數為40%的乙醇溶液分別在40、50、60、70、80℃條件下回流提取50m in。

1.2.3.2乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響準確稱取1.00g的水飛薊莖粉5份，分別置于錐形瓶中，料液比為1∶40，分別加入體積分數為10%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液，在60℃條件下回流提取50min。

1.2.3.3料液比對總黃酮提取量的影響準確稱取1.00g的水飛薊莖粉5份，分別置于錐形瓶中，分別加入料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的60%乙醇在60℃條件下回流提取50m in。

1.2.3.4提取時間對總黃酮提取量的影響準確稱取1.00g的水飛薊莖粉5份，分別置于錐形瓶中，料液比為1∶40，用體積分數為40%的乙醇溶液在60℃條件下分別提取10、30、50、70、90m in。

1.2.4響應面實驗根據單因素實驗結果，選取乙醇體積分數、料液比、提取溫度為對提取黃酮影響較顯著的三個因素，在固定提取時間50m in的條件下，根據Box-Beknhen實驗設計原理，以黃酮提取量為響應值，采用3因素3水平的響應面實驗表，進行響應面實驗確定水飛薊莖中總黃酮提取的最佳工藝。因素水平編碼表如表1所示。

表1　響應面因素水平編碼表Table 1　Factors and levers of response surface test

1.2.5數據處理本實驗中所用到的數據分析軟件是Design Expert.v 8.0和Spass Statistics 17.0。

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1　Standard curve of rutin

蘆丁線性回歸方程為：y=12.314x-0.0006，R2= 0.9996，在0～0.005mg/m L濃度范圍內有較好的線性關系。

2.2影響總黃酮提取的單因素實驗結果

2.2.1提取溫度對總黃酮提取量的影響不同提取溫度對水飛薊莖中總黃酮提取量影響的結果如圖2所示。

圖2　提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on total flavonoids yield

由圖2可知，當提取的溫度低于60℃時，隨著溫度的升高，黃酮的提取量增加；當溫度為60℃時，黃酮提取量達到最大，但當溫度繼續增加時，黃酮提取量反而下降。原因是溫度升高接近乙醇沸點有利于回流，提取量會增加，但是溫度過高可能會導致活性成分的破壞從而使黃酮的提取量下降［14］。

2.2.2乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響不同乙醇體積分數對水飛薊莖中總黃酮提取量的影響見圖3。

由圖3可知，隨著乙醇體積分數的提高，水飛薊莖中黃酮的提取量逐漸增大。當乙醇體積分數達到40%時，黃酮的提取量最高。超過該體積分數后，黃酮的提取量反而下降，同時葉綠色大部分溶出，通過用比色法來測定黃酮含量的結果帶來一定的影響，所以選擇乙醇體積分數40%左右比較適宜。

圖3　乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield

2.2.3料液比對總黃酮提取量的影響不同料液比對水飛薊莖中總黃酮提取量影響的結果如圖4所示。

圖4　料液比對總黃酮提取量的影響Fig.4　Effectof liquid-to-solid ratio on total flavonoids yield

由圖4可知，隨著料液比的增加，黃酮提取量逐漸增大，當料液比達到1∶40時，黃酮的提取量達到最大，當料液比超過1∶40時，黃酮的提取量逐漸下降且趨于平緩。

2.2.4提取時間對總黃酮提取量的影響不同提取時間對水飛薊莖中總黃酮提取量的影響見圖5。

圖5　提取時間對總黃酮提取量的影響Fig.5　Effectof extraction time on total flavonoids yield

由圖5可知，隨著浸提時間延長，黃酮提取量增加，當浸提時間是50m in時，黃酮提取量最高，達到4.60mg/g。繼續延長浸提的時間，黃酮提取量有所下降。可能是由于回流熱效應長時間作用會破壞黃酮，使其損失增大而影響黃酮的提取量從而產生負效應。

2.3響應面實驗

2.3.1響應面實驗結果響應面實驗結果如表2所示，利用Design Expert.v 8.0軟件進行回歸分析，得到水飛薊莖中黃酮提取量（Y）對乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取溫度（C）的二次多項回歸方程為：

表2　響應面實驗結果Table 2　Test design and results of response surface analysis

2.3.2回歸方程方差分析方差分析結果詳見表3所示，模型Prob＞F值小于0.01，表明該回歸方程極顯著，失擬項不顯著，同時B、BC、A2、B2、C2對黃酮提取量Y值的影響極顯著。從表3中可以看出，在所選取的因素中，對黃酮提取量的影響大小依次為：料液比＞乙醇體積分數＞提取溫度，并且模型的決定系數R2= 99.31%，大于90%，說明模型方程擬合程度好，可以用于黃酮提取實驗的理論預測。

2.3.3響應曲面分析根據回歸模型作出相應的響應面圖，見圖6～圖8。

圖6　乙醇體積分數和料液比對總黃酮提取量影響的響應面圖Fig.6　Response surface plot showing the interactive effectof ethanol concentration and material-liquid ratio on total flavonoids yield

從圖6中可以看出，等高線的形狀為偏圓形，表明乙醇體積分數A和料液比B交互作用不顯著。響應曲面較為陡峭，響應值隨料液比B的變化率大于乙醇體積分數A的變化率，說明在兩者的交互作用中料液比B對水飛薊莖中總黃酮含量的影響大于乙醇體積分數A。

表3　方差分析表Table 3　Analysis of variance for each term of the fitted regression equation

從圖7中可以看出，等高線的形狀偏圓形，表明乙醇體積分數A和提取溫度C的交互作用不顯著。響應曲面較為平滑，響應值隨乙醇體積分數A的變化率大于提取溫度C的變化率，說明在兩者的交互作用中乙醇體積分數A對水飛薊莖中黃酮的含量的影響大于提取溫度C。

圖7　提取溫度和乙醇體積分數對總黃酮提取量影響的響應面圖Fig.7　Response surface plot t showing the interactive effectof extraction temperature and ethanol concentration on total flavonoids yield

從圖8可以看出，等高線的形狀為橢圓形，表明料液比B和提取溫度C的交互作用極顯著，即水飛薊莖中黃酮含量受料液比B和提取溫度C的交互作用顯著。響應曲面較為陡峭，響應值隨料液比B的變化率大于提取溫度C的變化率，說明在兩者的交互作用中料液比B對水飛薊莖中黃酮的含量的影響大于提取溫度C。

圖8　提取溫度和料液比對總黃酮提取量影響的響應面圖Fig.8　Response surface plot showing the interactive effectof extraction temperature and material-liquid ratio on total flavonoids yield

2.4驗證實驗

根據響應面優化提取水飛薊莖中總黃酮的工藝，得到的最佳工藝條件為：乙醇體積分數39.35%，料液比1∶40.09，提取溫度61.04℃。結合實際情況并加以修正最終確定以乙醇體積分數40%，料液比1∶40，提取溫度61℃為驗證實驗的最佳工藝條件。進行3次平行驗證實驗，得到總黃酮的實際平均提取量為4.71mg/g，與理論值4.72mg/g接近。由此可認為實驗結果理想，實驗模型選擇合理。

3　結論與討論

首先通過單因素實驗分別考察料液比、提取時間、提取溫度和乙醇體積分數對水飛薊莖中總黃酮提取量的影響，在此基礎上，采用響應面法優化水飛薊莖中總黃酮的提取工藝，得到水飛薊莖中總黃酮提取的最佳工藝為：提取時間50min、提取溫度61℃、料液比1∶40、乙醇體積分數40%。此條件下，水飛薊莖中總黃酮的提取量達到4.71mg/g。

水飛薊莖中含有較高的總黃酮，是否能分離出水飛薊素，是否具有與水飛薊種子中黃酮相似的藥用和保健功能，還有必要做進一步實驗研究。由于黃酮類物質都在一定程度上具有保健功能，因此，水飛薊莖的開發利用將是水飛薊產業發展的新途徑。

［1］鄒浩軍，明亮.黃酮類化合物抗炎免疫及抗衰老藥理研究進展（綜述）［J］.安徽衛生職業技術學院學報，2004，2（6）：48-50.

［2］崔強，陳景超.黃酮類化合物生理活性及合成研究進展［J］.黑龍江科技信息，2011，20：031.

［3］陳義磊，馬國財，白紅進.刺山柑莖總黃酮提取液體外抗氧化活性的研究［J］.新疆農業科學，2011，47（12）：2489-2495.

［4］KREN V，WALTEROVA D.Silybin and silymarin：new effects and applications［J］.Biomedical Papers，2005，149：29-41.

［5］向昌國，向寧，黃成龍，等.響應面法優化刺槐花黃酮類化合物的微波提取工藝［J］.食品科學，2011，32（22）：32-36.

［6］曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進展［J］.西北植物學報，2003，23（12）：2241-2247.

［7］唐津忠，魯曉翔，陳瑞芳.金蓮花中黃酮類化合物的提取及其抗氧化性研究［J］.食品科學，2003，24（6）：88-91.

［8］張淑麗，楊世海，張海弢，等.水飛薊有效成分及其提取方法研究進展［J］.人參研究，2012，24（4）：51-54.

［9］KATIYAR S K，KORMAN N J，MUKHTAR H，et al. Protective effects of silymarin against photocarcinogenesis in a mouse skin model［J］.Journal of the National Cancer Institute，1997，89：556-566.

［10］FERENCIP，DRAGOSICSB.Randomized controlled trial of silymarin treatment in patients with cirrhosis of liver［J］.Journal of Hepatology，1989，9：105-113.

［11］TAGER M，DIETZMANN J，THIEL U，et al.Restoration of the cellular thiol status of peritoneal macrophages from CAPD patients by the flavonoids silibinin and silymarin.Free Radical Research，2001，34：137-151.

［12］王敏，張宇，張宏蓮，等.水飛薊莖葉化學成分研究［J］.黑龍江醫藥科學，2010，33（1）：78-79.

［13］喬孟，屈曉清，丁之恩.響應面法優化超聲波輔助提取湖北海棠葉中總黃酮工藝［J］.食品科學，2013，34（2）：143-147.

［14］鄧丹雯，楊佩，呂建壵，等.梅素提取工藝優化［J］.食品與發酵工業，2013（3）：210-215.

Optim ization extraction of total flavonoids from stem s of Silybum marianum by response surface methodology

YU Jin-yue，SUN Jing，LIXin-hua*，QIXiao-jun，WANG Hai-na
（Food College of Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China）

The flavonoids from stem s of Silybum marianum were extracted w ith ethanol，and the extraction p rocess was op tim ized by response surface methodology，four sing le factors testwere made to investigate the effects of extraction time，ethanol concentration，material-liquid ratio on total flavonoids yield.The research findings showed that the op tim ized cond itions were as follows：extraction time 50m in，extraction tem perature 61℃，ethanol concentration 40%，material-liquid ratio 1∶40.Under the cond itions，the yield of flavonoids was 4.71g/mg w ith results of a polynom ial regressionmodelwere in ag reement.

stem s of Silybum marianum；total flavonoids；response surface methodology；extraction p rocess

TS202.3

B

1002-0306（2015）06-0295-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.056

2014-06-17

于金躍（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學。

李新華（1955-），男，碩士，教授，研究方向：糧食加工與轉化。