腸膜明串珠菌BD1710在TSM中的產糖條件優化

韓瑨，吳正鈞，游春蘋，徐曉芬

（1.乳業生物技術國家重點實驗室，上海200436，2.上海乳業生物工程技術研究中心，上海200436，3.光明乳業研究院，光明乳業股份有限公司，上海200436）

腸膜明串珠菌BD1710在TSM中的產糖條件優化

韓瑨1，吳正鈞2，游春蘋3，徐曉芬3

（1.乳業生物技術國家重點實驗室，上海200436，2.上海乳業生物工程技術研究中心，上海200436，3.光明乳業研究院，光明乳業股份有限公司，上海200436）

研究了腸膜明串珠菌BD1710（L.mesenteroides BD1710，CGMCC NO.6432）以TSM為基料時，接種量、初始pH、番茄汁濃度、蔗糖濃度、發酵溫度對多糖產量的影響，同時，比較了腸膜明串珠菌BD1710在最優條件下發酵TSM和CDM的多糖產量，并對所獲得的多糖組成進行了分析。結果表明：腸膜明串珠菌BD1710發酵TSM產多糖的最適條件分別為接種量2.0%（體積分數）、初始pH 7.0、番茄汁濃度100%（體積分數）、蔗糖濃度15%、發酵溫度28℃。在優化條件下，腸膜明串珠菌BD1710的多糖產量最高可達32.15 g/L，與在CDM中多糖的產量相當。采用乙醇沉淀的方法從BD1710發酵TSM得到的多糖碳水化合物含量為97.54%，蛋白質含量為0.72%。因此，TSM可替代CDM來應用于明串珠菌合成多糖。

腸膜明串珠菌BD1710；TSM；多糖；葡聚糖

以乳酸菌、土壤桿菌、根瘤菌等為代表的微生物代謝產生的多糖是一種微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的一類由單一或多種單糖以糖苷鍵聚合而成的高分子化合物，根據存在形式的不同可分為莢膜多糖和粘液多糖2種。大量研究證實，乳酸菌胞外多糖不但可以賦予發酵乳制品特殊的風味［1］、改善產品質地與口感［2］，還具有一定的降血壓［3］、降血脂、免疫調節和抗腫瘤等保健功能［4-5］。在食品添加劑（如增稠劑、乳化劑、穩定劑等）的安全性受到廣泛關注的情況下，乳酸菌胞外多糖因其良好的安全性和卓越的生理與加工性能，將在醫藥、日用化妝品和食品行業得到更廣泛的應用。

腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是最早應用于商業化生產多糖的乳酸菌之一，可以合成主鏈由不同糖苷鍵類型構成、比例迥異的葡聚糖（Glucan，一類主鏈以葡萄糖為單糖組成單位，由α-（1→3）、α-（1→4）或α-（1→6）糖苷鍵鍵合而成的特殊多糖）［6］，如主鏈僅以α-（1→6）糖苷鍵將葡萄糖聚合而成的dextran［7］，主鏈由α-（1→6）和α-（1→3）交替鍵合而成的alternan［8］等。研究表明，由L.mesenteroides產生的各種葡聚糖不僅可以改善發酵制品的質地，而且在生物分離（SephadexRgels）、醫藥（代血漿）等領域被廣泛應用［9］。然而，在目前制備明串珠菌來源的多糖的工藝中，發酵基料大多為化學合成培養基（Chemically defined medium，CDM）［10］，其組成復雜、部分成分來源緊缺，導致發酵基料成本高昂；采用這些基料發酵后，在提取制備多糖的過程中，通常為了去除蛋白質等干擾物質而加入氯仿、正丁醇（Sevag法）［11］、三氟三氯乙烷（三氟三氯乙烷法）［12］、三氯乙酸（三氯乙酸法）［13］等有機溶劑，這些因素對商業化生產的成本、多糖的品質以及多糖在食品、醫療領域應用的安全性均存在不良影響。因此，尋找一種來源廣泛、價格低廉的明串珠菌產糖介質，同時提高多糖的產率和品質，是明串珠菌多糖制備方法的關鍵。

前期研究發現，L.mesenteroides BD1710（CGMCC NO.6432）可在預調pH和添加蔗糖的番茄汁蔗糖培養基（tomato juice-sucrose medium，TSM）中發酵產糖，因此，本文對TSM發酵產糖的條件進行了優化，比較了L.mesenteroides BD 1710在優化條件下和在CDM培養基中多糖的產量，同時對采用乙醇沉淀法獲得的多糖的組成進行了分析。

1材料與方法

1.1菌種與試驗材料

菌種：L.mesenteroides BD1710（CGMCC 0847）。

試驗材料：M17瓊脂/液體培養基：OXOID LTD.，英國；蔗糖、蛋白胨、酵母抽提物、K2HPO4、MgSO4· 7H2O、MnSO4、NaCl、CaCl2、FeSO4、NaOH、無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司，上海；番茄：市售。

1.2主要儀器設備

HVE-50型高壓滅菌鍋：HIR AYAMA公司；AVANTI J30I型高速冷凍離心機：美國BECKMAN COULTER公司；FreeZone 12型真空冷凍干燥機：美國LABCONCO公司；SQ2130Z型榨汁機：上海帥佳電子科技有限公司；PB-10型pH計：美國Sartorius公司。

1.3方法

1.3.1發酵種子液的制備

將L.mesenteroides BD1710的凍干粉以少量無菌蒸餾水溶解，用接種環挑取一環劃線于M17蔗糖瓊脂培養（以5.0%蔗糖取代M17培養基中0.5%的乳糖，在120℃下滅菌20 min即得）上，28℃好氧培養24 h取出，用接種環挑取單菌落接入1 mL M17蔗糖液體培養基中，采用渦旋混合儀將細胞均勻分散后，28℃、180 r/min搖床培養48 h取出，再以2%（體積分數）接種量接種于50 mL上述M17蔗糖液體培養基中，于28℃、180 r/min搖床培養48 h，即得發酵用的種子。

1.3.2發酵培養基的制備

番茄汁的制備：成熟番茄清洗、去皮，榨汁，果汁部分經多層紗布過濾后，經15 000 r/min離心10 min，取清液即得。

TSM的制備：向20%～100%（體積分數）的番茄汁中加入5.0%～20.0%的蔗糖，加熱溶解并冷卻后，用5.0 mol/L NaOH調節pH至5.0～10.0，在120℃下滅菌20 min即得所需蔗糖濃度和pH的無菌TSM。

CDM的制備：將蛋白胨10 g、酵母抽提物5 g、蔗糖150 g、K2HPO420 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO40.01 g、NaCl 0.01 g、CaCl20.02 g、FeSO40.01 g與1 L蒸餾水混勻，充分溶解后，以堿調節pH至7.0，在120℃下滅菌20 min即得所需的無菌CDM。

1.3.3多糖的制備

將發酵液在沸水浴30min，冷卻至室溫后加入4倍（體積分數）的無菌水稀釋，15 000 r/min離心10 min，取上清，加入3倍體積經過預冷的無水乙醇，靜置過夜，15 000 r/min離心10 min，收集沉淀物，沉淀采用少量無水乙醇洗滌后，采用蒸餾水溶解后經真空冷凍干燥后即得多糖。

1.3.4產糖條件的優化

1.3.4.1不同接種量對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

分別將L.mesenteroides BD1710種子液按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%（體積分數）的接種量接入上述方法制備的TSM中，該TSM中含番茄汁100%（體積分數）、蔗糖15%，pH為7.0，28℃、180 r/min搖床培養，并于不同的培養時間，取發酵液按1.3.3所述方法制備多糖并稱重。

1.3.4.2不同初始pH對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

分別將L.mesenteroides BD1710種子液以2.0%（體積分數）的接種量分別接入初始pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的TSM中，該TSM中含番茄汁100%（體積分數），蔗糖15.0%，28℃、180 r/min搖床培養48 h后將發酵液按1.3.3所述方法制備多糖并稱重。

1.3.4.3不同番茄汁濃度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

分別將L.mesenteroides BD1710種子液以2.0%（體積分數）的接種量接入番茄汁濃度為20%、40%、60%、80%、100%（體積分數）（番茄汁與蒸餾水的比例），蔗糖含量為15.0%，初始pH為7.0的TSM中，28℃、180 r/min搖床培養48 h后將發酵液按1.3.3所述方法制備多糖并稱重。

1.3.4.4不同蔗糖濃度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

分別將L.mesenteroides BD1710種子液以2.0%（體積分數）的接種量接入番茄汁濃度為100%（體積分數），蔗糖含量為5.0%、10.0%、15.0%、20.0%（w/ v），pH為7.0的TSM中，28℃、180 r/min搖床培養，并于不同的培養時間，取發酵液按1.3.3所述方法制備多糖并稱重。

1.3.4.5不同發酵溫度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

將L.mesenteroides BD1710種子液以2.0%（體積分數）的接種量接入番茄汁濃度為100%（體積分數），蔗糖含量為15.0%（w/v）、pH為7.0的TSM中，分別置于25、28、31、34℃、轉速為180 r/min的搖床培養48 h發酵結束后將發酵液按1.3.3所述方法制備多糖并稱重。

1.3.4.6L.mesenteroides BD1710在TSM和CDM中的產糖能力比較

將L.mesenteroides BD1710以2.0%（體積分數）接種量接入上述方法制備的初始為pH7.0的TSM和CDM中，其中TSM含番茄汁100%（體積分數），蔗糖15%（w/v），28℃、180 r/min搖床培養54 h，取不同培養時間的發酵液按1.3.3所述方法制備多糖并稱重。

1.3.5L.mesenteroides BD1710多糖的蛋白質與碳水化合物含量

將1.3.3方法制備獲得的多糖樣品以凱氏定氮法［14］和硫酸苯酚法［15］來測定其蛋白質與碳水化合物含量。

2結果

2.1不同接種量對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

將L.mesenteroides BD1710的發酵種子液以不同接種量接入含含番茄汁100%（體積分數）、蔗糖15%，pH為7.0的培養基中，28℃、180 r/min搖床培養，不同時間獲得的發酵液中多糖的含量如圖1所示。

在發酵前9小時，不同接種量的發酵液中多糖含量差異不顯著，說明在發酵初期，BD1710在TSM中的增殖速率緩慢或主要以積累菌體生物量為主，不同接種量對明串珠菌產糖能力影響不明顯。

隨著發酵時間的延長，在9 h至30 h這段時間里，不同接種量的發酵液中多糖含量均呈明顯上升趨勢，菌株代謝蔗糖產多糖的能力逐漸增強。從圖1可以看出，在相同的取樣時間點，接種量越大的發酵液中多糖含量越高，如24 h的各發酵液中多糖含量分別為：22.3 g/L（0.5%）、25.2 g/L（1.0%）、28.4 g/L（2.0%）、29.8 g/L（4.0%）。

當發酵時間大于30 h時，各發酵液中累積的多糖總量增加緩慢，主要是由于發酵液粘稠性的增加和發酵液pH的降低，影響了菌株的活性，同時，蔗糖作為明串珠菌合成葡聚糖的底物，隨著葡聚糖的合成被大量消耗（數據未顯示），從而阻礙發酵液中多糖的進一步積累。

比對2.0%（體積分數）和4.0%（體積分數）接種量的發酵液中多糖含量后發現，兩者對L.mesenteroides BD1710的產糖量影響無顯著差異（P＞0.05），后續實驗均采用2.0%（體積分數）接種量作為最適接種量。

2.2不同初始pH對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

發酵終點處（48 h），不同初始pH的發酵液中多糖含量如圖2所示。

圖2　發酵液初始pH對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響Fig.2Effect of initial medium pH on polysaccharide production by L.mesenteroides BD1710

初始pH為5.0的發酵液中多糖產量最低，僅為7.2 g/L，而多糖產量最高（32.15 g/L）的發酵液初始pH為7.0，其他初始pH條件下的多糖產量處于同一水平，為26.72 g/L（pH 6.0）、26.0 g/L（pH 8.0）、25.3 g/L（pH 9.0）和24.8 g/L（pH 10.0）。發酵液pH的高低與微生物的活力、胞壁酶的活性及其代謝產物（多糖等）產量等相關，本實驗中，初始pH 7.0的發酵液中多糖得率最高，說明該pH更利于L.mesenteroides BD1710發酵產糖，因此是最適的初始pH條件。

2.3不同番茄汁濃度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

不同番茄汁濃度的發酵液中多糖含量如圖3所示。

圖3　番茄汁濃度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響Fig.3Effect of tomato juice concentration on polysaccharide production by L.mesenteroides BD1710

隨著番茄汁濃度的增加，多糖產量也相應增加，番茄汁中營養成分的濃度與多糖產量呈正相關性，其中，當各番茄汁濃度的發酵液中多糖含量分別為5.0、10.6、14.4、18.4、32.15 g/L。這是因為添加了100%（體積分數）番茄汁的培養基中所含營養成分最充足，其促進L.mesenteroides BD1710合成多糖的因子比其他添加量的培養基更充沛，因此，100%（體積分數）番茄汁是該培養基的最適添加量。

2.4不同蔗糖濃度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

圖4　蔗糖濃度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響Fig.4Effect of sucrose concentration on polysaccharide production by L.mesenteroides BD1710

作為多糖合成代謝作用的直接底物，蔗糖的濃度與L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響息息相關，尤其與培養基中代謝底物充分度和滲透壓大小的有直接關聯。過低的蔗糖濃度會因代謝底物不充足而使多糖產量縮減，過高的蔗糖濃度則會因滲透壓過高而降低細菌細胞膜的通透性，從而降低了菌株的活力，同樣會影響目標產物的合成。從圖4中可知，L. mesenteroides BD1710在蔗糖濃度15%的TSM中代謝蔗糖產生的多糖含量最高，為32.15 g/L，說明蔗糖濃度15%（w/v）的培養基對L.mesenteroides BD1710而言代謝底物充沛、滲透壓力適中，是L.mesenteroides BD1710發酵產多糖的最佳蔗糖濃度。

2.5發酵溫度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響

發酵溫度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響見圖5。

圖5　發酵溫度對L.mesenteroides BD1710多糖產量的影響Fig.5Effect of fermentation temperature on polysaccharide production by L.mesenteroides BD1710

如圖5所示，在相同濃度的TSM中，L.mesenteroides BD1710在28℃培養時多糖的產量最高，表明28℃利于BD1710利用蔗糖合成與積累葡聚糖。因此，選擇28℃作為L.mesenteroides BD1710產糖的最優發酵溫度。

2.6L.mesenteroides BD1710在TSM和CDM中的產糖能力比較

圖6　L.mesenteroides BD1710在TSM和CDM中的產糖能力Fig.6Polysaccharide-production of L.mesenteroides BD1710 fermenting in TSM and CDM

如圖6所示，L.mesenteroides BD1710在2種培養基中的發酵產糖趨勢相似，2種發酵液中的多糖含量均在接種后6 h內緩慢積累，6 h～24 h快速增長，24 h后趨于穩定。從多糖產量來看，L.mesenteroides BD1710在CDM中多糖最高產率為29.6 g/L，而在TSM中最高可達32.15 g/L，這可能是兩者組分差異造成的。CDM雖然添加了蛋白胨、酵母抽提物等營養成分以及一些無機鹽來調控和促進菌體細胞的生長與代謝作用［16-17］，但相對于TSM而言，營養組成不夠全面，有報道指出，番茄汁中含有植物纖維、番茄紅素、β-胡蘿卜素、維生素C和一些微量元素（硒、錳、鋅等）［18］，對L.acidophilus、L.bulgaricus、L.plantarum等乳酸菌均有一定的生長刺激效果［19-22］。因此，TSM對L.mesenteroides BD1710促生長作用更強，其產糖量也隨著菌株的迅速繁殖而大大增強。

2.7L.mesenteroides BD1710多糖組成分析

采用乙醇沉淀的方法從L.mesenteroides BD1710發酵TSM獲得的多糖，采用凱氏定氮和硫酸苯酚法測定后，所獲得的多糖碳水化合物含量（以葡萄糖計）和蛋白質與碳水化合物含量分別為97.54%和0.72%。

同時所獲得的多糖經過進一步去蛋白純化后，經過單糖組成、傅利葉變形紅外分析（FT-IR）、核磁共振（NMR）等分析后，為含有少量分支的右旋糖苷（數據未公開）。

3討論

從上世紀40、50年代開始，有關L.mesenteroides的研究主要圍繞著菌株的分類、篩選與計數方法［23-24］、培養基的優化［10，16］、代謝產物（多糖［25］、甘露醇［26］、維生素［27］、生物膜［28］）的分析等方面展開。直到本世紀初期，對L.mesenteroides的報導開始側重于利用突變株、培養條件優化以及改變相關產糖酶表達途徑等方式來提高多糖產量。Singh A等發現，通過紫外照射后的L. mesenteroides NRRL B-1146突變株多糖產量最多可提高5倍以上［29］。Claire M等將L.mesenteroides NRRL B-512F中編碼右旋糖苷蔗糖酶（Dextransucrase，EC 2.4.1.5）的dsrS進行重組并異源表達于Escherichia coli，以此法獲得的右旋糖苷蔗糖酶活性比出發株提高了30倍［30］。借助響應面的方法，Avishek M等先后確定了L.mesenteroides NRRL B-1146產葡聚糖蔗糖酶的最適培養基濃度，L.mesenteroides NRRL B-1146和B-640產葡聚糖的優選培養基濃度［31-32］。盡管以提高多糖產量為目的，科研人員進行了各方面的嘗試與努力，但發酵產糖過程卻始終在CDM中完成，這些培養基成分復雜，部分組成來源緊缺，導致發酵基料成本高昂，而且，采用這些基料發酵的多糖在純化過程中通常會伴有有機溶劑殘留的問題，這會直接影響多糖的商業化生產成本，及其在食品、醫療領域的廣泛應用。因此，尋找一種來源天然，應用安全的明串珠菌產糖培養基，同時提高多糖的提純效率與品質將是未來多糖制備工業的主要趨勢之一。

本研究在前期L.mesenteroides BD1710發酵TSM產糖性能初步明確的基礎上，首先對TSM發酵產糖的條件進行了優化，發現接種量2.0%（體積分數）、初始pH 7.0、番茄汁濃度100%（體積分數）、蔗糖濃度15%（w/v）、發酵溫度28℃為L.mesenteroides BD1710發酵TSM產多糖的最優條件。隨后，比較了優化條件下L. mesenteroides BD1710發酵TSM和CDM培養基中的多糖產量，結果顯示前者的多糖得率高于后者10%左右。最后測定了L.mesenteroides BD1710多糖的蛋白質與碳水化合物含量，分別為0.72%（質量分數）和97.54%（質量分數）。

得益于番茄汁本身蛋白質含量低的特點［18］，以TSM為發酵基料獲得的多糖蛋白質含量低，碳水化合物濃度高，表明以此法制備多糖在簡化生產步驟、降低生產成本提高生產效率的同時，更增強了產品的安全性，因此，TSM可作為一種天然發酵基料用于大規模制備L.mesenteroides葡聚糖。

4結論

1）L.mesenteroides BD1710代謝TSM產生多糖的最適發酵條件為接種量2.0%（體積分數）、初始pH 7.0、番茄汁濃度100%（體積分數）、蔗糖濃度15%、發酵溫度28℃。

2）L.mesenteroides BD1710在TSM中的多糖產率略高于CDM，可以作為一種大規模制備明串珠菌葡聚糖的培養介質。

3）采用乙醇沉淀法從L.mesenteroides BD1710發酵TSM獲得的多糖碳水化合物含量與蛋白含量分別為97.54%和0.72%。

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Optimization of the Condition for Leuconostoc mesenteroides BD1710 to Biosynthesis Glycan in Tomato Juice-sucrose Medium

HAN Jin1，WU Zheng-jun2，YOU Chun-ping3，XU Xiao-fen3
（1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Shanghai 200436，China，2.Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology，Shanghai 200436，China，3.Dairy Research Institute，Bright Dairy&Foods Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

The condition for Leuconostoc mesenteroides BD1710 to biosynthesis glycan in tomato juice-sucrose medium was optimizized，which was a combination of a medium composed of pure tomato juice supplemented with 15%sucrose，with the initial pH value of the medium adjusted to 7.0，and the fermentation undertaken at 28℃with an inoculation ratio of 2.0%.Under the optimized conditions，the glycan synthesized by L. mesenteroides BD1710 in the tomato juice-sucrose medium could reached 32.15 g/L，at the same level or a little higher than the yield of glycan by the same bacterial strain in a reported chemically defined medium suitable for Leuconostoc mesenteroides to express polysaccharides.The polymers obtained from the fermented tomato juice-sucrose medium by L.mesenteroides BD1710 via alchol participation was composed of 97.54% carbohydrate and 0.72%protein，respectively.Therefore，tomato juice-sucrose medium could be an alternative of chemically defined medium for L.mesenteroides strains to biosynthesis glycan.

Leuconostoc mesenteroides BD1710；tomato juice-sucrose medium；exopolysaccharide；glycan

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.032

2013-11-21

韓瑨（1980—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：乳品科學。