Xpert MTB/RIF技術在基層實驗室結核病診斷中的應用研究

王怡心1 陳雄豪2★ 林惠玲1 蔣英1

Xpert MTB/RIF技術在基層實驗室結核病診斷中的應用研究

王怡心1 陳雄豪2★ 林惠玲1 蔣英1

目的評估結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（Xpert MTB/ RIF）在基層實驗室結核病診斷中的可行性與準確性。方法對1 042例來自區級結核病防治單位門診初診者的痰液樣品，分別進行涂片鏡檢、固體培養、傳統比例法藥敏試驗和Xpert MTB/RIF檢測，分析比較Xpert MTB/RIF法和傳統方法檢測痰標本中的Mtb及其耐藥性的敏感度、特異度及檢測耗時。結果以固體培養試驗結果作為金標準，Xpert Mtb/RIF方法檢測痰標本Mtb的敏感度和特異度分別93.7％（655/699）和87.5％（300/343）。以傳統比例法藥敏試驗結果為金標準，Xpert Mtb/RIF方法檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為86.8％（79/91）和95.3％（531/557）。Xpert MTB/RIF系統平均檢測耗時為2 h。結論Xpert Mtb/RIF檢測操作簡單、快速，檢測敏感度高于涂片鏡檢法，與固體培養法有極好的一致性，同時該方法可以診斷患者是否對利福平耐藥，在我國縣（區）級實驗室具有非常好的應用前景。

結核分支桿菌；利福平；Gene Xpert檢測；敏感度與特異度

在當今社會結核病仍然是一個重要的公共衛生問題，據報道世界上約有三分之一的人口感染結核桿菌，其中每年新發病人約有900萬，死亡人數高達300萬［1］。隨著耐多藥的病例日益增多，這將造成結核病更加瘋狂的流行。而在我國結核疫情十分嚴峻，具有感染人數多、死亡人數多、耐藥人數多和傳染性肺結核患病率高的特點。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）強調遏制結核病的主要方法是普及高效和以人為本的檢測診斷技術，而快速檢測和可靠的耐藥性測試是先決條件［2］。然而，世界的許多地區，結核病診斷仍然依賴于不敏感、缺乏標準化的抗酸桿菌染色法和耗時很長且要求標本含有存活的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）才能培養。至于藥敏試驗，目前WHO已經推薦了常用的固體和液體培養基的一線和二線抗結核藥物藥敏試驗方法所需要的藥物臨界濃度和臨界比例［3］，但固體培養和液體培養方法分別需要4 w和2 w才能報告藥敏結果。基于上述提到的現有實驗室診斷方法的局限性，隨著結核病實驗室診斷技術的不斷發展，新型的分子檢測方法即結核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（xpert mycobacterium tuberculosis/rifampin，Xpert MTB/ RIF）已經受到廣泛關注。目前WHO十分認可Xpert MTB/RIF，并認為“這種檢測方法可能對結核病的治療和控制帶來革命性變化，是全球結核病診斷和治療方面的一個重要里程碑”。在經過了18個月的嚴格評估，2010年12月WHO正式推薦使用Xpert MTB/RIF技術作為一種全新的結核病快速檢測新方法用于結核病及利福平耐藥的檢測。為了評估該技術在基層實驗室結核病診斷中的可行性與準確性，本研究擬對1 042例疑似結核病患者的痰標本分別采用傳統方法和Xpert MTB/ RIF法進行檢測，通過比對檢測的敏感度、特異度及檢測耗時評價Xpert MTB/RIF法在基層實驗室的應用前景。

1　方法

1.1實驗對象

1 042份痰標本來自2012年10月至2014年12月在深圳市6個區級慢性病防治院就診的疑似結核病患者。

1.2研究方法

所有標本分別進行涂片鏡檢、羅氏固體培養、比例法藥敏試驗和Xpert MTB/RIF檢測。

1.2.1抗酸染色

按照中國結核病防治規劃《痰涂片鏡榆標準化操作及質量保證手冊》中要求進行操作。

1.2.2分離培養及藥敏試驗

采用4％氫氧化鈉處理法，用無菌操作的方法將標本接種于改良羅氏培養基的斜面上，37℃分別培養3 d和7 d后各觀察1次。此后，每周觀察1次生長情況并記錄，培養至陽性結果出現，或60天后無生長判斷為陰性結果。一旦培養基上出現菌落，即進行抗酸染色涂片確認是抗酸桿菌，然后進行生化實驗菌種鑒定及藥敏，培養陽性標本參照《結核病細菌學檢驗規程》［4］。

1.2.3Xpert MTB/RIF檢測

將標本與含氫氧化鈉及異丙醇的處理液常規按1∶2比例混合（若痰中含膿球則為1∶3），震蕩，室溫靜置15 min，再將混合液轉移至一次性多室塑料反應盒中，置于Gene Xpert檢測系統（美國Cepheid公司）進行全自動檢測，約2 h即可在檢測軟件窗口直接讀取結果。

1.3統計學分析

采用SPSS 19.0對Xpert MTB/RIF及涂片法與固體培養法的檢測結果進行一致性檢驗（Kappa檢驗），K＜0.4為一致性差，在0.40～0.75之間為一致性好，K≥0.75為一致性極好。涂片法與Xpert MTB/RIF的敏感度、特異度比較及Xpert MTB/RIF與比例法檢測利福平耐藥率的比較使用χ2檢驗，P＜0.05有統計學差異。

2　結果

2.1Xpert MTB/RIF對痰標本Mtb的檢測結果

表1中顯示，以固體培養結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測1 042例樣本中Mtb的敏感度為93.7％（655/699）、特異度為87.5％（300/343），總體符合率為91.7％；涂片法檢測結果的敏感度為84.3％（589/699）、特異度為94.5％（324/343），總體符合率為87.6％。對Xpert MTB/RIF和固體培養進行Kappa檢驗，K=0.811，兩者具有極好的一致性。對涂片法和固體培養進行Kappa檢驗，K= 0.737，兩者具有好的一致性。但以固體培養結果為金標準，涂片法與Xpert MTB/RIF的敏感度、特異度比較均有統計學差異（χ2值分別為31.787與10.213，相對應的P值分別為0.000與0.001），Xpert MTB/RIF法敏感度優于涂片法，涂片度的特異性優于Xpert MTB/RIF法。

表1　以固體培養試驗為金標準，Xpert MTB/RIF檢測Mtb分析Table 1Mtb analysis by Xpert MTB/RIF based on the solid culture result

2.2Xpert MTB/RIF檢測對利福平耐藥分析

表2結果中，以比例法藥敏結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測648例利福平耐藥結果的敏感度為86.8％（79/91）、特異度為95.3％（531/557），Xpert MTB/RIF與比例法對利福平耐藥性的檢出率無統計學差異，χ2值為1.178，P=0.278＞0.05。

表2　以比例法藥敏試驗金標準，Xpert MTB/RIF檢測對利福平耐藥分析Table 2Rifampin resistance analysis of Xpert MTB/RIF based on the conventional drug susceptibility test result

2.3檢測時間

本次實驗全部完成的時間僅用2 h，比目前大多數的肺結核實驗室診斷技術有很大的時間優勢。

3　討論

Gene Xpert實時熒光定量核酸擴增檢測技術采用的是巢式實時熒光聚合酶鏈反應體外診斷方法，它整合了傳統PCR檢測所需的樣品的制備，核酸的提取、擴增，目標序列的檢測等全部步驟。其采用了獨立的一次性試劑盒，并由系統自動完成，相比傳統的PCR方法，具有操作簡便、生物安全性高、檢測過程不易受干擾等優點。Xpert MTB/RIF檢測試劑盒能檢測樣本中的結核桿菌和與利福平耐藥相關的rpoB基因，能對耐多藥患者進行初篩，此外它有很高的敏感性和特異性，檢驗周期也非常短。正是基于上述的巨大優勢，WHO將這一檢測方法納入其工作規劃的建議和指導，并且發布各國的推薦和執行手冊，推薦將此新技術合并到各國的結核病防治計劃，并強烈推薦此方法應作為低中收入國家對耐藥性結核病和結核病/艾滋病聯合感染的首選檢測方法。因痰液行抗酸染色陽性率較低，且結核病痰樣本結核菌數目需＞5 000條/mL才能得到陽性結果［5］。涂片法亦有其它缺點，如抗酸桿菌包括結核分枝桿菌及非結核分枝桿菌，即使抗酸染色陽性亦不能說明是否為結核分枝桿菌感染。本次實驗中的Xpert MTB/RIF法對結核桿菌檢測的敏感度為93.7％，明顯優于涂片法的84.3％，與固體培養法進行比較，兩者具有極好的一致性，同時在110例涂片法陰性而固體培養法為陽性樣品中，Xpert MTB/RIF檢測結果陽性80例，陰性30例，由此可見該方法可作為抗酸染色鏡檢的后續檢測手段［6-9］。

本實驗在區級結核病防治機構采用臨床就診的疑似結核病患者的痰標本，通過Xpert MTB/ RIF檢測其Mtb及利福平耐藥性的敏感度、特異度及檢測耗時。結果顯示，Mtb的敏感度到達93.7％、特異度為87.5％，其中，敏感度與2010年在南美洲、非洲和亞洲多個國家級結核病實驗室共同對1 843例患者進行Xpert MTB/RIF檢測報道的結果96.0％相近，而特異度略低于國外報道的98.6％［10］，特異度略低于國外相關報道，可能是由于我國是以傳統固體培養試驗作為金標準，而國外多以敏感性較高的液體培養作為金標準［11］的原因所導致。同時近年來國內有研究發現，針對不同的檢測標本Gene Xpert的敏感度和特異度顯示出不同的差異。李輝等［12］提出Xpert MTB/RIF檢測Mtb對于涂片陽性標本檢測的敏感度高，對于臨床診斷為肺結核標本的敏感度較低，而特異度則相反，這說明用Xpert MTB/RIF檢測方法在檢測不同標本時，敏感度與特異度之間需要需求平衡，但對于不同標本Gene Xpert都顯示出很高的特異度。

目前，利福平耐藥作為耐多藥的主要參考標準，以比例法藥敏試驗為金標準，Xpert MTB/RIF檢測Mtb對利福平耐藥性檢測的敏感度和特異度分別為86.8％和95.3％，敏感度也略低于國外相關報道的97.6％［10］，張治國等［11］提出將比例法藥敏試驗和差異菌株測序結果聯合作為金標準，其敏感度和特異度都能得到提升。耐利福平分支桿菌的耐藥基因雖然多集中在81 bp的核心突變區，但在我國不同的地域人群中利福平耐藥菌株的rpoB基因的突變頻率不盡相同［13］，但Gene Xpert是通過檢測rpoB基因片段核心突變區來診斷耐利福平結核病。有研究通過比較我國不同地域標本，結果顯示Mtb對利福平耐藥具有較高的敏感度和特異度以及與傳統金標準藥敏試驗較高的一致性［12］。這個就進一步顯示出Xpert MTB/RIF檢測方法在我國具有較強的實用性。

Xpert MTB/RIF的檢測平均耗時為2小時，而痰涂片要1天，液體培養需要半個月、固體培養要超過1個月才能得出結果，而對利福平的藥敏檢則需要超過2個月的時間。這其中時間成本的差別是顯而易見的。

Xpert MTB/RIF也存在某些自身的問題及局限性，如本次實驗就有51例無利福平耐藥結果。這可能除了跟Gene Xpert儀器的注射器和探測信號有關，更大程度可能是與留取的標本質量有關，如標本不足1mL、標本為唾液、標本為帶有血液或食物殘渣的不合格樣本［14］，這些都有可能導致測試失敗。其它不足之處還有：Xpert MTB/RIF在兒童結核病診斷方面的實驗結果并不樂觀［15-16］；該技術不能檢測異煙肼等耐藥情況；對肺外標本有關的檢測證據有限；試劑盒成本較高等。而且到目前為止，全球尚未發表有關該系統對結核病傳播控制的效果研究報告，而且絕大部分研究都是在參比實驗室完成，缺乏在門診或縣區級實驗室使用效果的詳細數據［17］。但是Xpert MTB/RIF作為一種快速、直接可靠、高敏感度、特異度地檢測出結核病患者及是否對利福平耐藥的新診斷技術，可以幫助臨床醫生發現越來越多的常規檢測不易發現的結核病人，以及比常規方法預先發現耐多藥結核病。而且目前Gene Xpert儀器除了用于普通結核病診斷外，也已經開始用于檢測白血病、腸病毒和鏈球菌等多種病原微生物，但是由于設備價格和使用成本比較高，短期而言要大范圍推廣會有一定的困難。從2013年起中國全球基金給全國幾十家基層結核病防治機構陸續配發了Gene Xpert檢測系統并在全國范圍內舉行了多期培訓班，這就大大促進了Gene Xpert檢測系統的推廣和使用。WHO建議加快Xpert MTB/RIF檢測技術作為一種全新的結核病快速診斷新工具的使用。由于該儀器僅需要兩個獨立區域，這種較低的硬件設施要求使其未來可以在更多的縣、區級基層實驗室開展，有助于結核病患者較早的得到準確的診斷、充分的治療和患者管理［18］。本實驗也在某種程度上再次證明該方法在我國基層實驗室對于結核病診斷及利福平耐藥患者的篩查方面具有一定的意義和前景。

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Application research of Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosisin in the primary laboratory

WANG Yixin1，CHEN Xionghao2★，LIN Huiling1，JIANG Ying1
（1.Department of Laboratory Medicine，Futian District Hospital for Prevention and Treatment of Chronic Diseases，Shenzhen，Guangdong，China，518048；2.Department of Laboratory Medicine，Futian District Maternal and Child Health Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518048）

ObjectiveTo investigate the feasibility and accuracy of Xpert MTB/RIF assay in the diagnosis of tuberculosis in primary laboratory.Methods1 042 sputum samples from patients with clinically suspected tuberculosis from clinics in Shenzhen were collected.And the sensitivity，specificity and test time of different detection methods，including smear test，solid culture，traditional proportion method drug susceptibility test，and Xpert MTB/RIF test，in the detection rate of mycobacterium tuberculosis（MTB）and rifampicin resistance，were analyzed.ResultsCompared with the results of the solid culture test，the sensitivity and specificity of the Xpert MTB/RIF for MTB respectively were 93.7％（655/699）and 87.5％（300/343）.Compared with the results of traditional proportion method drug susceptibility test，the sensitivity and specificity of the Xpert MTB/RIF for in the detection rate of rifampicin resistance respectively were 86.8％（79/91）and 95.3％（531/557），and the mean of test time of Xpert MTB/RIF was 2.1 hours（range，1.8-2.6 hours）.Conclusion

Mycobacterium tuberculosis；Rifampin；Gene Xpert test；Sensitivity and specificity

·綜述·

1.深圳市福田區慢性病防治院檢驗科，廣東，深圳518048 2.深圳市福田區婦幼保健院檢驗科，廣東，深圳518048

陳雄豪，E-mail：raky1111@163.com

Compared with other test methods，Xpert MTB/RIF test significantly improved the diagnositic sensitivity and specificity for MTB.Xpert MTB/RIF test can be used to detect rifampicin resistance.And Xpert MTB/RIF test will provide a specific method for the early diagnosis of tuberculosis.