曼氏迭宮絳蟲annexinB8的生物信息學分析和基因克隆

梁培1 呂剛1 周曉君2 陳新新1 陳小靜1 符瑞佳1★

·論著·

曼氏迭宮絳蟲annexinB8的生物信息學分析和基因克隆

梁培1 呂剛1 周曉君2 陳新新1 陳小靜1 符瑞佳1★

目的通過生物信息學預測曼氏迭宮絳蟲annexinB8（SmannexinB8）的生物學特征，及潛在功能和結構，并且進行基因克隆，為下一步SmannexinB8參與宿主免疫調節研究提供依據。方法通過NCBI的ORF finder工具對SmannexinB8的開放閱讀框進行分析，利用ExPASy網站進行蛋白的物理化學參數、信號肽、跨膜螺旋、潛在分子生物學功能的預測，通過NCBI/BLAST對蛋白保守功能域進行檢測。不同物種的annexin序列從NCBI網站獲取，并利用Vector NTI suit 8.0和TreeView軟件進行分析。利用SWISS-MODEL網站和SPDBV 4.10軟件分析SmannexinB8蛋白的三維空間結構。此外，對SmannexinB8基因進行擴增，并克隆到原核表達載體pET-28a（+）。結果SmannexinB8是一個全長基因，編碼347個氨基酸。蛋白由4個典型的annexin重復結構域組成，序列當中沒有信號肽，是一個穩定的可溶性蛋白分子。三維空間立體結構分析結果顯示SmannexinB8是一個保守的蛋白。SmannexinB8與多房棘球絳蟲、口膜殼絳蟲、細粒棘球絳蟲、華支睪吸蟲以及人類的annexin基因的同源性分別是68％，67％，65％，46％和40％。分子進化分析顯示SmannexinB8與絳蟲屬的親源性最近，而與其他物種，如吸蟲、哺乳動物親源性較遠。結論SmannexinB8可能具有抑制磷脂酶A2的活性，促進細胞融合、參與調節免疫反應和離子通道形成的功能，可能在參與宿主免疫調節中起到關鍵性的作用。

曼氏迭宮絳蟲；annexin B8；生物信息學分析；多功能

曼氏迭宮絳蟲是迭宮絳蟲屬之一，其主要分布在中國、日本、韓國和泰國［1］。裂頭蚴是曼氏迭宮絳蟲的幼蟲，能夠導致嚴重的人獸共患寄生蟲病和威脅公共健康。在中國，超過1 000人感染了裂頭蚴，他們分別來自27個省、自治區和直轄市［2］。曼氏迭宮絳蟲的終宿主是肉食哺乳動物，包括狗和貓，第一中間宿主是橈足動物，第二中間宿主是脊椎動物，如爬行動物、鳥類和哺乳動物［3］。盡管有關于人感染曼氏迭宮絳蟲成蟲的報道，但是人通常作為第二中間宿主［4］。人感染裂頭蚴主要是通過喝了含有裂頭蚴感染劍水蚤的生水或是食用感染有裂頭蚴的生青蛙肉或蛇肉。另外一個不可忽視的感染途徑是將含有裂頭蚴的生青蛙肉或是蛇肉用于治療皮膚潰瘍或是眼部炎癥［5，6］。裂頭蚴進入人體之后，能夠寄生在各種組織，例如眼睛、皮下組織、內臟器官和腦部。裂頭蚴感染能夠導致嚴重的眼部疾病、組織損傷和腦部功能紊亂。

annexin是依賴鈣離子的磷脂結合蛋白，具有多種生物學功能，25年前就已被發現，第一個被分離和純化是人annexinA7［7］。annexin分為A家族（在脊椎動物中）、B家族（無脊椎動物）、C家族（在真菌類和一些單細胞真核生物）、D類家族（在植物中）和家族E（在原生生物中）［8］。annexin獨特的核心區域是4個相似的重復結構域，每個重復結構域由約70個氨基酸組成，并且含有一個結合鈣離子特征性的“typeⅡ”或“typeⅢ”結構。annexin能夠與各種參與細胞的結構組成、細胞信號轉導和控制生長的細胞膜成分相互作用。annexin還能夠作為非典型的鈣離子通道。許多研究顯示annexin在寄生蟲中參與了寄生蟲與宿主之間的相互作用，并參與宿主的免疫調節［9］。豬帶絳蟲囊尾蚴的annexinB1被證實在體外能夠抑制磷脂酶A2的活性，并且是annexins中的一個分泌成分［10］。在華支睪吸蟲中，annexinB30被證實是華支睪吸蟲的分泌排泄抗原成分之一，能夠在鈣離子存在的情況下結合磷脂和人纖溶酶原［11］。牛裂體吸蟲的annexin在體外具有溶解纖維蛋白和抗凝的特性，可能對寄生蟲在血液中存活發揮重要作用［12］。曼氏裂體吸蟲的annexin 2被認為是一個潛在的疫苗候選分子［13］。在麝貓后睪吸蟲中，annexin定位在寄生蟲的體表，并且可能在免疫反應調節中發揮了作用［14］。

在本次研究中，我們鑒定了來源于曼氏迭宮絳蟲的SmannexinB8基因，并且進行了關于潛在生物化學特性的生物信息學分析。我們的結果表明SmannexinB8可能是一個分泌蛋白，能夠抑制磷脂酶A2的活性，在寄生蟲和宿主相互作用中發揮了非常重要的作用。

1　材料與方法

1.1SmannexinB8核酸序列分析

從狗腸中分離的成蟲用來構建曼氏迭宮絳蟲的cDNA文庫，得到的EST標簽由上海聯眾基因科技研究院完成測序，編碼SmannexinB8的cDNA序列從該文庫調取，其開放閱讀框是通過利用（http：// www.expasy.org/）中的ORF finder tool進行查找。

1.2SmannexinB8氨基酸序列分析

SmannexinB8蛋白的物理化學參數是通過ExPASy ProtParam獲取。并利用ExPASy網站進行該蛋白的信號肽和跨膜螺旋的預測。SmannexinB8的保守功能域是通過NCBI/BLAST Home進行檢測。利用ExPASy PredictProtein進行SmannexinB8分子功能和生物學過程本體分析，預測該蛋白具有的潛在分子生物學功能。

1.3同源性和分子進化樹分析

為了進行同源性和分子進化樹分析，我們通過NCBI中獲取了不同物種的annexin序列，利用生物信息學分析軟件Vector NTI suit 8.0和TreeView進行結果分析。

1.4SmannexinB8結構模型構建

SmannexinB8三維空間是利用編碼蛋白的氨基酸通過SWISS-MODEL進行預測和SPDBV 4.10進行結果分析。

1.5SmannexinB8基因克隆

SmannexinB8的開放閱讀框以曼氏迭宮絳蟲文庫中的cDNA作為模板利用PCR的方法進行擴增，特異性的PCR引物是通過Primer Premier 5.0 and PCRDESIGN軟件進行設計的，上游和下游引物分別是5′-TAAGAGCTCATGCTGCGTTACAG TCG-3′；5′-TTCTCGAGTTAGCACCCAATTAGG GC-3′。擴增的反應條件如下：94℃變性45 s，55℃退火45 s、72℃延伸1 min，共35循環，72℃穩定10 min。PCR產物純化后，利用相同的限制性內切酶進行酶切并與預先酶切好的原核表達載體pET-28a（+）進行連接。重組的質粒通過DNA測序驗證，然后轉入到大腸埃希菌DH5α中。

2　結果

2.1核酸序列分析

ORF finder結果顯示SmannexinB8核酸序列是全長序列，由1 044個堿基對組成，見圖1。

圖1　曼氏迭宮絳蟲SmannexinB8的開放閱讀框Figure 1The open reading frame of SmannexinB8

2.2編碼氨基酸的特征

SmannexinB8蛋白由347個氨基酸組成，如圖2所示。氨基酸組成部分主要為Leu，Ala，Glu和Asp，分別占了12.4％，10.4％，8.9％and 7.5％。預測該蛋白的理論分子量是38.7 kDa，理論pI值是4.95。該蛋白在哺乳動物中的半衰期是30 h，在酵母和大腸埃希桿菌中體內表達的半衰期分別大于20 h和10 h。該蛋白是一個穩定的蛋白，其不穩定系數是31.15。預測的C值、S值和Y值都低于0.5，這提示了該蛋白沒有信號肽，如圖3A所示。跨膜螺旋分析結果顯示了該蛋白不是一個跨膜蛋白，可能是一個可溶性的蛋白分子，如圖3B所示。

圖2　曼氏迭宮絳蟲SmannexinB8的氨基酸組成Figure 2Amino acid composition of SmannexinB8

2.3同源性和進化樹分析

通過annexin的多序列比對，結果如圖4顯示，SmannexinB8編碼氨基酸序列與多房棘球絳蟲、口膜殼絳蟲、細粒棘球絳蟲、華支睪吸蟲和人的annexin基因的同源性分別是68％，67％，65％，46％and 40％。該蛋白是由4個annexin重復結構域組成，同源功能域包含了一個特殊的typeⅢ（“GxGTDE”結構）鈣離子結合位點，這個結構能夠增強鈣離子和磷脂之間的親和力。此外，K/H/ RGD結構分別在重復結構域Ⅱ和Ⅲ中。IRI結構與人、豬帶絳蟲和糞類圓線蟲中的重復結構域IV相互識別，IRI結構具有肌動蛋白結合功能，而在SmannexinB8中編碼氨基酸發生了變化。

圖3　曼氏迭宮絳蟲Smannexin B8的功能區域分析Figure 3Analysis of Smannexin B8 functional domains

SmannexinB8的分子進化樹結果顯示SmannexinB8與絳蟲屬（多房棘球絳蟲和口膜殼絳蟲）親源性更近，而與其他例如吸蟲屬和哺乳動物親源性較遠，見圖5。

2.4SmannexinB8結構模型

SmannexinB8的保守功能區由4個annexin重復結構域組成（圖6A）。該結構域的組成分別是26（aa）-88（aa）、100（aa）-171（aa）、204（aa）-268（aa）和280（aa）-344（aa）。通過SWISS-MODEL對SmannexinB8的三維空間結構進行預測，如圖6B所示。其中，4個結構域分別由4種不同原子方式顯示出來。

2.5分子功能和生物過程的本體論分析

分子功能分析顯示SmannexinB8能夠與鈣離子依賴性磷脂、鈣離子、磷脂酰絲氨酸和真核細胞表面等相結合，該蛋白還具有結構分子活性和抑制磷脂酶A2的功能。同時，SmannexinB8在抗凋亡、細胞形狀調節、細胞增殖、信號轉導、細胞內鈣離子平衡、細胞之間黏附和炎癥反應的生物過程中都發揮重要的作用。

2.6SmannexinB8基因的分子克隆

SmannexinB8全長基因經特異性引物進行PCR擴增后得到，然后克隆到原核表達載體pET-28a（+）中，重組質粒通過DNA測序和限制性內切酶Sac1和Xhol1酶切鑒定證實，雙酶切得到的條帶分別與PCR產物和pET-28a（+）質粒的條帶相一致（圖7）。

3　討論

annexin是一個存在多種真核細胞中并參與鈣離子和膜結合蛋白表達的家族［15］。該家族成員具有各種功能，如參與細胞的活動、鈣離子信號轉導和生長調節。在本實驗研究中，SmannexinB8是第一次被鑒別和進行生物信息學分析。SmannexinB8的結構和潛在功能特征也進行了描述。在我們實驗研究中，SmannexinB8的全長序列從曼氏迭宮絳蟲的成蟲cDNA文庫中分離得到（圖1），由347氨基酸組成。雖然annexins是胞內蛋白，不僅能定位在細胞質中，也能與細胞膜和細胞骨架蛋白結合［16］。盡管SmannexinB8缺乏分泌信號肽且不屬于膜蛋白，但是許多研究證實該蛋白存在于細胞外［17-20］。在豬帶絳蟲中，annexinB1通過蛋白印跡分析在囊尾蚴的囊液中和囊尾蚴感染的豬血清中檢測到［10］。這結果提示annexinB1屬于annexin家族中的分泌蛋白。annexinB30也分別通過LC-MS/MS［21］和蛋白印跡實驗證實是華支睪吸蟲的分泌排泄抗原之一［11］。另外，進化樹分析結果顯示，SmannexinB8與多房棘球絳蟲和華支睪吸蟲親源性也較近。綜合以上結果，SmannexinB8可能是曼氏迭宮絳蟲分泌排泄抗原成分之一。蟲體釋放的分泌排泄抗原能夠導致病理變化和參與逃避宿主免疫清除和寄生蟲吸收營養［22-23］。因此，SmannexinB8可能在寄生蟲存活和寄生蟲與宿主相互作用中是一個至關重要的分子。

圖4　曼氏迭宮絳蟲annexinB8與其他物種annexin的序列比對Figure 4Alignment of SmannexinB8 amino acid sequence with annexin from other species

圖5　細粒棘球絳蟲annexinB8的分子進化樹Figure 5Molecular evolution tree of the SmannexinB8

圖6　曼氏迭宮絳蟲annexinB8典型的4個重復序列分析Figure 6Analysis of 4 repeats of SmannexinB8

圖7　SmannexinB8基因的原核表達載體構建Figure 7Cloning of gene encoding Smannexin B8

annexin多序列比對結果顯示SmannexinB8的編碼氨基酸序列與人annexin序列相似性只有40％。由于SmannexinB8與人annexin的同源性相對較低，所以SmannexinB8有望成為控制人類裂頭蚴病的有價值的疫苗開發靶點。該蛋白同源功能域中含有“GxGTDE”結構，說明SmannexinB8擁有特征性的typeⅢ的鈣離子結合位點。該位點能夠使其與鈣離子和磷脂高親和力結合［8，16］。由于結合鈣離子的KGD結構位于repeatⅡ和repeatⅢ之間，SmannexinB8可能擁有在鈣離子存在時結合磷脂的特性。此外，KGD結構在膜相互作用和受體靶標中的作用闡明了annexin的功能［24］。然而，與人annexin相比，IRI肌動蛋白結合結構被其他氨基酸代替。有些annexin在體外直接與聚合肌動蛋白相互作用，從而參與調節、穩定和介導細胞膜肌動蛋白［25］。事實上，也有報道提示了IRI結構存在與否都不影響annexin結合肌動蛋白［26］。此外，該蛋白的保守功能域和它的三維空間結構分析顯示SmannexinB8保持它的結構完整性。生物過程和分子功能本體論分析提示SmannexinB8參與多種重要生物功能，例如鈣離子依賴的磷脂相互作用、抗凋亡、細胞增生和炎癥調節。SmannexinB8還參與細胞內鈣離子平衡和抑制磷脂酶A2的活性，磷脂酶A2是脂質炎癥調節中的限速步驟。而控制磷脂酶A2的活性是調節炎癥過程的重要環節［27］。在豬帶絳蟲研究中發現，annexinB1通過抑制哺乳動物的磷脂酶A2來下調宿主的炎癥反應［10］。此外，還有研究報道annexin也可能是通過釋放IL-10介導炎癥反應［28］。這些都提示了SmannexinB8可能通過抑制磷脂酶A2活性和介導IL-10釋放來參與免疫反應。在生物學過程的本體論分析中，SmannexinB8在抗凋亡中發揮重要作用。凋亡是生理細胞死亡的過程，在這個過程當中，細胞可以在沒有誘發免疫反應的情況下，從體內清除［27］。McKanna的研究發現在經歷凋亡的乳腺導管的肺泡細胞中，annexin1的表達中顯著增加［29］。許多的研究也證實了在一些細胞中，annexin1可能通過發揮鈣離子流的作用來參與調節細胞的凋亡［30］。此外，SmannexinB8的理論分子量和pI值分別是38.7 kDa和4.95。該蛋白是屬于穩定的蛋白，并且原核表達質粒已經構建成功。這些實驗結果為進一步的實驗研究奠定了扎實的基礎。

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Sequence bioinformatics analysis and gene cloning of annexinB8 from Spirometra mansoni

LIANG Pei1，LV Gang1，ZHOU Xiaojun2，CHEN Xinxin1，CHEN Xiaojing1，FU Ruijia1★
（1.Department of Pathogen Biology，Hainan Medical College，Haikou，Hainan，China，571199；2.Clinical Laboratory，Hainan Province People's Hospital，Haikou，Hainan，China，570311）

ObjectiveTo provide information and solid materials for further research on annexinB8 of Spirometra mansoni（SmannexinB8）which may participate in mediating host immune response.Methods The open reading frame of SmannexinB8 was found with ORF finder tool in NCBI website.ExPASy website was used to predict the physical and chemical parameters of protein，signal peptide，transmembrane helices and potential molecular and biological functions.The conserved domains of the protein were detected by NCBI/BLAST Home.In order to analyze the homology and phylogenetic tree，sequences of annexins from various species were obtained from NCBI website，and the results were analyzed by Vector NTI suit 8.0 and TreeView software.The three-dimensional structure of SmannexinB8 was predicted by SWISS-MODEL and was analyzed by SPDBV 4.10.Moreover，the gene was amplified and cloned into a prokaryotic expression vector pET-28a（+）.ResultsSmannexinB8 was full-length gene and encoded 347 amino acid residues. The protein was composed of four annexin repeats without signal peptide and a stably soluble molecule.Itwas a conservative annexin in three-dimensional structure.SmannexinB8 was homologous to annexins from Echinococcus multilocularis，Hymenolepis microstoma，Echinococcus granulosus，Clonorchis sinensis and Homo sapiens with 68％，67％，65％，46％and 40％identities，respectively.SmannexinB8 clustered with the annexins from the tapeworm genus，but not with other species like trematode and mammal animals.Conclusions SmannexinB8 might have a multitude of functions：inhibition of phospholipase A2，promoting fusion，mediating immune response and formation of ion channel.SmannexinB8 might play a critical role in the host immune response.

Spirometra mansoni；AnnexinB8；Bioinformatics analysis；Multi-functions

國家自然科學基金課題（81260254）；海南省自然科學基金課題（814289）

1.海南醫學院病原生物學教研室，海南，海口571199 2.海南省人民醫院檢驗科，海南，海口570311

符瑞佳，E-mail：18171809@qq.com