木薯干旱脅迫響應基因MeGSTU7自然變異分析

鄧德力　王斌　曾長英　郭鑫　彭明

摘 要 在2個木薯品種中檢測MeGSTU7基因在不同干旱脅迫階段的表達量變化，并克隆測序了60個木薯品種的基因區DNA序列，分析基因核苷酸多態性及其自然變異，并將核苷酸多態性與干旱脅迫表型關聯分析，挖掘優等位變異。結果表明，干旱脅迫條件下，2個品種的MeGSTU7的表達量均上調。MeGSTU7基因區核苷酸變異豐富，共有23個SNP位點，A/G突變為主；外顯子區總計10個同義突變，12個非同義突變；外顯子區在品種資源群體中有4種主要單倍型，所有的單倍型分為兩大類，分子進化分析表明，MeGSTU7的外顯子區的兩端受到很強的正選擇作用；Q+K+MLM混合線性模型關聯分析結果表明，1個Indel和2個SNP與干旱脅迫下地上部鮮重耐旱系數顯著關聯，并篩選得到了優等位變異。

關鍵詞 谷胱甘肽轉移酶；MeGSTU7；木薯；抗旱；自然變異；單倍型

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A

Abstract Glutathione-S-transferase（GST）plays an important role in glutathione conjugation reaction and involves in many physiological and biochemical reaction in plants including stress resistance， primary metabolism and cellular signal transduction. MeGSTU7 codes GST in cassava（Manihot esculenta crantz）. In order to research the function of MeGSTU7 in drought-resisting， the expression quantity of MeGSTU7 was detected in two cassava varieties which are tolerant and sensitive to water stress in different degrees of drought stress. MeGSTU7 was cloned from 60 cassava varieties and sequenced. Sequceces were analyzed to study the single nucleotide polymorphism（SNP）and the natural variation. Correlation analysis between single nucleotide polymorphism and drought phenotype was made to select the excellent allelic variations. The results indicated that the expression of MeGSTU7 in two cassava varieties were up-regulated under drought stress. Nucleotide polymorphism in the gene regions of MeGSTU7 was abundant with 23 SNP among which the A/G mutation type was the major. There were 10 synonymous changes and 12 replacement changes in exon regions. All of the haplotypes were divided into two types among which 4 haplotypes were the major in population. Molecular evolution showed that intense positive selection function at the ends of the exon in MeGSTU7. By Q+K+MLM mixed linear model， one Indel and 2 SNP were significantly associated with the fresh weight of aerial parts in the stress of drought and excellent allelic variations were selected. In conclusion， this paper lays a good foundation for further research of the function of MeGSTU7 in drought resistant and the selection of excellent allelic variations.

Key words Glutathione-S-transferase； MeGSTU7； Cassava； Drought-resisting； Natural variation； Haploidtype

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.011

谷胱甘肽轉移酶（glutathione-S-transferase， GST）在谷胱甘肽（glutathione， GSH）結合反應時起到關鍵作用，催化谷胱甘肽結合反應的起始。植物中，所有GSTs蛋白都是由2個25 ku亞基組成的蛋白二聚體，每一個GST亞基包含獨立的催化位點[1]。谷胱甘肽轉移酶超家族（GST）可根據蛋白序列相似性以及基因結構分為六大類：phi（F）、tau（U）、theta（T）、zeta（Z）、lambda（L）和dehydroascorbate reductase（DHAR）[2]。MeGSTU7蛋白屬于tau（U）類，該類型谷胱甘肽轉移酶是植物中所特有的[3]。

1.2.8 基因結構分析 在JGI數據庫phytozome10（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）的木薯基因組序列，獲得木薯品種AM560的MeGSTU7基因的CDS序列（coding sequence）以及DNA序列（genomic sequence），用NCBI的Spidey（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/）分析其基因結構，并用DNAMAN軟件繪制基因結構圖。

1.2.9 序列多樣性分析 利用MEGA4.0軟件進行序列比對，對齊序列之后輸出.MEG格式文件，然后導入DnaSPv5.0軟件[21]分析MeGSTU7基因DNA序列的核苷酸多樣性，包括SNP和Indel的數目及其在外顯子，內含子，保守結構域的分布，同義突變和非同義替換。并統計氨基酸的極性變換及對蛋白質理化性質的影響。

1.2.10 外顯子區單倍型分析 根據NCBI的Spidey工具分析的MeGSTU7基因的基因結構，使用BioEdit軟件[22]批量去除5′-UTR和3′-UTR序列以及內含子序列，獲得MeGSTU7的CDS序列之后，導入DnaSPv5.0軟件進行sliding windows單倍型分析，windows長度設為45 bp，step長度設為3 bp，并導出NRF文件。使用Network軟件（Fluxus Technology， Ltd）繪制單倍型網絡。

1.2.11 SNP與干旱表型的關聯分析 使用31對隨機分布于木薯基因組上的多態性SSR標記對60個品種的DNA進行擴增，擴增PCR程序參照Lin等[23]的方法，毛細管電泳檢測，片段統計方法參照Wang等[18]的方法。最終得到83個多態性片段。將SSR基因型數據導入Structure軟件[18]進行群體結構分析，burnin和MCMC分別設為100 000和100 000，K值從1到10，每個K值重復3次，根據隨著K值的變化，LnP（D）值大小及△K的拐點判斷K=6，然后用CLUMPP軟件[24]合并K=6對應的3個Q值矩陣，輸出結果作為協方差導入TASSEL2.1軟件進行關聯分析。同時利用31個SSR標記的基因型信息導入TASSEL軟件計算Kinship矩陣。

單個SNP位點與干旱表型導入TASSEL軟件，利用SSR分型的數據計算家系效應和群體結構將兩者作為協方差進行Q+K+MLM的關聯分析，分析結果參照Benjamin的方法[18]進行P值糾正，糾正后的P值<0.05時，就表示該SNP位點是與干旱表型顯著關聯。SNP位點優等位變異表型值的計算參照文自翔等[25]的方法。單倍型間干旱表型的方差分析使用SPSS18.0軟件進行分析。將MeGSTU7基因區的SNP數據導入TASSEL，利用Q+K+MLM混合線性模型進行關聯分析，剔除MAF<5%的SNP位點，并將P值用FDR方法糾正。

2 結果與分析

2.1 基因結構與蛋白保守結構域分析

JGI收錄的MeGSTU7基因區全長985 bp，該基因含有2個外顯子和1個內含子，2個外顯子被1個87 bp的內含子隔開。其CDS序列長度為702 bp，編碼233個氨基酸。本研究克隆的DNA序列包括20 bp 5′-UTR、23 bp 3′-UTR和2個外顯子區及1個內含子，總長為832 bp。利用NCBI保守結構域網站對其氨基酸序列進行保守結構域分析，MeGSTU7所編碼蛋白總長為233個氨基酸，含有3個保守結構域（表2），是一個典型的tau類的GST家族蛋白成員，包括了2個GST亞基。

2.2 表達模式

干旱脅迫條件下，兩個木薯品種的MeGSTU7基因表達量如圖1所示。干旱脅迫條件下，MeGSTU7基因表達量均上調表達，且在同一干旱脅迫時間點，MeGSTU7基因在2個木薯品種表達量RQ值相近。在干旱14 d并復水24 h后，MeGSTU7基因在2個木薯品種中的表達量迅速下調，回復到與對照組表達量相當的水平。這表明：MeGSTU7響應干旱脅迫信號，可能參與了木薯干旱脅迫響應信號途徑。

2.3 單核苷酸多態性分析

測序區間覆蓋了20 bp的5′-UTR區和23 bp的3′-UTR區，共有27個單核苷酸多態性變異位點（SNP），和2個Indel變異，其中MAF>5%的SNP位點有11個，稀有SNP有16個。Indel變異全部位于5′-UTR區。總體27個SNP位點中，5個位于UTR區，內含子中只含有1個SNP位點。SNP類型以A/G突變為主，其次是C/T，顛換突變有20個，轉換突變有6個。在起始密碼子ATG的第24個核苷酸處，有A/T/G 3種堿基變異（表3）。使用DnaSPv5.0軟件的Sliding windows方法分析MeGSTU7基因核苷酸多樣性，結果如圖2所示，外顯子區Pi值在100 bp前后、200 bp前后、550 bp前后、720 bp前后和800 bp達到較高值，其余部分均在較低水平。這些高Pi值區域均分布在外顯子區域，其中前2個在外顯子1上，后3個區域分布在外顯子2上（圖2）。

2個外顯子區總計10個同義突變，12個非同義突變。保守結構域包括6個同義突變和5個非同義突變（表3）。總體11個2種堿基變異的SNP位點導致10個氨基酸變異，SNP24有3種堿基變異，導致其所在的密碼子編碼3種不同的氨基酸。總體12個氨基酸位置的氨基酸變異中，8個位置的氨基酸種類發生變異，但不改變氨基酸的極性；4個位置的氨基酸存在種類變異和極性差異，保守結構域內有4個氨基酸變異，其中1個氨基酸種類和極性變異位于其tau類GST C端保守結構域內，其余3個僅氨基酸種類發生變異，并不改變氨基酸的親水性。2個氨基酸的座位有3種氨基酸種類變異。

2.4 外顯子區單倍型分析及其分子進化分析

對60份干旱處理木薯品種的MeGSTU7基因進行單倍型分析，結果表明60個品種共分為28種單倍型，包括4種主要單倍型（P>0.05）（圖3和表4），分為兩大類TypeⅠ和TypeⅡ。TypeⅠ包括Hap7、Hap15及其衍生的9種單倍型；TypeⅡ包括Hap1、Hap2及其衍生的15種單倍型。Hap2、Hap15、Hap7和Hap1包括的品種數占總體群體大小的比例分別為48.3%、20%、16.7%和15%。4種主要單倍型之間存在4個SNP變異，其中3個同義突變，1個非同義突變。60個木薯品種的MeGSTU7基因包括2種單倍型雜合和僅1種單倍型的品種數各占總體的50%。對單倍型的兩大類型進行分子進化分析（Ka/Ks），結果如圖4所示，在MeGSTU7的cDNA的5′端40～45 bp堿基處和3′端679～687 bp堿基處均檢測到Ka/Ks>>1，說明在這兩個位置，受到極顯著的正選擇作用。

2.5 MeGSTU7基因區SNP與干旱表型關聯分析

經關聯分析得到了1個Indel標記和2個SNP標記與地上部鮮重的耐旱系數顯著關聯。結果如表5所示，Indel10是位于5′-UTR區的單堿基插入/缺失多態性位點，其對表型變異解釋率達到了12.0%，優等位變異為A單堿基插入，其表型值為0.139；SNP93位于第1外顯子的A/T變異，但是該位點的SNP為同義突變，不導致氨基酸變異。SNP93對表型變異解釋率為11.26%，優等位變異為A，其表型值為0.047；SNP525位于第2外顯子，該位點為非同義突變，編碼氨基酸為谷氨酰胺/組氨酸，對表型變異解釋率為10.25%，優等位變異為G，其表型值為0.06。本研究還比較了4種主要單倍型，發現4種主要單倍型的平均值不存在顯著性差異，方差分析和多重比較均未達到顯著性水平。

3 討論與結論

實驗結果顯示MeGSTU7蛋白包含了一個C端tau類谷胱甘肽轉移酶α螺旋結構域；一個N端硫氧還蛋白折疊結構域。2006年， 楊海靈等[26]對谷胱甘肽轉移酶的結構進行了總結，C端的谷胱甘肽轉移酶α螺旋結構域和N端的硫氧還蛋白折疊結構域正是谷胱甘肽轉移酶的典型三級結構。由此可知，木薯MeGSTU7基因是一個典型的谷胱甘肽轉移酶編碼基因。

本研究熒光定量PCR結果表明MeGSTU7基因響應干旱脅迫，且對水分信號十分敏感，在復水24 h后其表達量迅速下調。說明了MeGSTU7的表達受逆境誘導，與前人研究結果相符[10]。而復水24 h后其表達量迅速下調至正常水平的原因，可能是因為復水過后木薯生理生化反應改變，體內自由基等有害物質減少，從而刺激信號傳導，引起內源調節基因對MeGSTU7表達進行調節。2012年，梁明[27]的研究顯示，桑樹干旱復水后，體內主要保護酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活性回復到正常澆水水平。MeGSTU7基因表達的響應機理有可能如上述所說。2000年，Loyall等[6]的研究顯示，GSTs可作為脅迫信號蛋白，在植物受到脅迫時起到信號傳導作用。因此，對于MeGSTU7基因在木薯干旱復水后表達量迅速下調回復到正常澆水水平的另一種可能的解釋是MeGSTU7在木薯受到干旱脅迫時是作為脅迫信號蛋白行使功能。但確切的解釋和內在機制有待進一步的研究。

MeGSTU7基因變異豐富，SNP位點多且主要集中在CDS序列兩端的外顯子上。非同義突變在總SNP位點中所占比例大，可能會影響到所編碼蛋白的理化性質及高級結構，從而對酶活性產生影響。MeGSTU7基因在60份木薯品種中存在4種主要單倍型，4種主要單倍型之間只有4個SNP的差異，其中兩個SNP與干旱脅迫下木薯地上部鮮重耐旱系數顯著關聯，但是在4種主要單倍型之間，地上部鮮重耐旱系數平均值差異不顯著。4種主要單倍型分為兩大類，分子進化分析顯示，在這兩大類單倍型基因區兩端會受到正向選擇作用，人們在培育高抗旱性木薯過程中，對表型的篩選可能會將這些優等位基因變異固定下來。在所有SNP中，只有2個SNP和一個Indel與干旱表型有關聯。Indel位于5′UTR區，可能是無意義的關聯，也可能是由于與其他功能SNP處于單倍型之中，也可能是具有功能的插入/缺失突變，但具體的原因需要重復實驗和基因功能方面的研究證據。2個關聯SNP有1個是同義突變，1個非同義突變，SNP93可能是與SNP525處于強連鎖不平衡狀態，所以被一起檢測到。SNP525是位于第二外顯子區的非同義突變，并且位于C端GST亞基上，可能是具有功能的SNP突變位點。總之，本研究的結果為進一步研究MeGSTU7基因自然變異與木薯抗旱的關系，深入研究堿基變異與基因表達和功能之間的聯系提供了證據。

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