番茄HDACs家族基因在脅迫條件下的表達分析

李濤　蘇慧慧　李植良　徐小萬　王恒明　李穎　黎振興

摘 要 組蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）家族基因在植物的生長發育、器官構建及逆境脅迫和激素信號應答中發揮重要作用。利用生物信息學方法對番茄的HDACs家族成員、分布及結構和功能等進行分析。結果表明，番茄HDACs家族包含15個成員，分為3個亞家族。遺傳進化分析表明，番茄HDACs家族成員與擬南芥HDACs家族具有相似分類。利用實時熒光定量PCR對番茄HDACs家族基因的組織表達分析表明，HDACs具有組織特異性表達差異，SlHDT1、SlHDT2和SlHDT3在根中表達較高，而SlHDA1、SlHDA3、SlHDA5、SlHDA6在果實發育過程中表達較高；利用RT-PCR對番茄HDACs的脅迫響應分析表明，在鹽、SA、ABA、高溫和低溫脅迫條件下，15個番茄HDACs成員的表達模式不同，其中部分基因的表達水平被顯著地誘導增加或者降低，推測這些基因很可能參與了調控番茄逆境脅迫條件下的防御應答反應。結果將為進一步解析番茄HDACs家族基因的功能奠定基礎。

關鍵詞 番茄；組蛋白去乙酰化酶；表達分析；氧化脅迫；青枯病

中圖分類號 S641.2 文獻標識碼 A

Abstract Histone acetylation and deacetylation play an important role in the regulation of eukaryotic gene expression， and implicated in plant development， organ formation， stress response， and hormonal signaling. In this study， our analysis revealed the presence of 15 genes encoding HDAC proteins in the tomato genome， the distribution on the chromosome， the structure and function of proteins were analyzed. HDAC proteins could be classified into 3 groups based on phylogenetic analysis. Ten of them belonged to RPD3/HDA1， and other members had similar classification with Arabidopsis thaliana， which was supported with the organization of predicted conserved putative motifs in HDAC proteins. The analysis of the developmental tomato expression profiling data with Q-PC， indicated that SlHDT1， SlHDT2 and SlHDT3 were highly expressed in roots， in addition， the transcripts of SlHDA1， SlHDA3， SlHDA5 and SlHDA6 were accumulated in fruits. Fifteen HDACs genes showed distinct expression patterns in response to stresses of salt， SA， ABA， high temperature and cold， the expressions of several genes were significantly up/down regulated， implying that these members might participate in regulating the defense response against abiotic stresses. The results would provide a very useful reference for the cloning and functional analysis of each member of HDAC gene family in Solanaceae crops.

Key words Tomato； Histone deacetylation； Gene expression； Oxidative stress； Bacterial wilt

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.012

植物在生長過程中會不斷受到來自環境的生物和非生物脅迫，非生物脅迫如干旱、冷害、高鹽等，生物脅迫如細菌、真菌、病毒等[1]。植物經脅迫誘導后發生一系列生理生化變化，如多種信號途徑的激活，功能性調控蛋白的誘導表達等，來應變和抵抗這些不良環境對其生長發育的影響[2]。組蛋白修飾在基因表達調控方面扮演重要角色，組蛋白通過組蛋白乙酰轉移酶（Histone acetyltransferase，HATs）促進基因表達，而組蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDACs）抑制基因表達。組蛋白乙酰化酶（HATs）根據序列特征劃分為5個不同的家族：GNAT、MYST、p300/CREB結合蛋白（CBP）輔激活物、TAF II250、HATs。組蛋白去乙酰化酶（HDACs）在植物中劃分為RPD3/HDA1、SIR2和HD2這3個亞家族[3]，其中前2個分別與酵母RPD3/HDA1、SIR2家族同源，而HD2家族是植物特有的家族[4]。有研究結果表明；組蛋白乙酰化和去乙酰化主要參與植物的生長發育，其中包括根發育[5]、花發育[6]、配子體發育[7]、器官生長過程中細胞的增殖等[8]；也參與植物應對外界環境變化，如光信號[9]、鹽脅迫[10]、冷害[11]、熱脅迫[12]、脫落酸（abscisic acid，ABA）信號途徑，以及一些其他的激素信號途徑[13]。

前人對植物如擬南芥[3]、水稻[14]、玉米[15]、大麥[16]、葡萄[17]和番茄[18-21]組蛋白乙酰化基因家族進行生物信息學和基因功能研究；Pandey等[3]對植物組蛋白乙酰化家族基因進行了分析，并首次發現番茄HDT1101、HDT1102和HDT1103隸屬于HD2家族。Aiese等[18]2013年通過全基因組系統分析了番茄中組蛋白甲基化和乙酰化家族成員進化關系，同時利用S. pennellii近等基因系（ILs）進行定位和果實發育過程中的表達分析，研究發現番茄中有32個組蛋白乙酰基轉移酶（Histone acetyltransferase，HATs）和15個組蛋白去乙酰基酶（Histone deacetylase，HDACs），而且這些酶在番茄果實發育過程中具有不同的表達變化；盧晶霞[18-19]和Zhao等[20]2014年通過酵母雙雜交分析發現，番茄HDAC可能參與番茄的果實發育。而番茄HDACs在氧化脅迫研究方面還未見報道[21]。鑒于HDACs家族的重要生理功能，本研究利用生物信息學方法對番茄HDACs家族開展氧化脅迫及接種青枯病條件下的表達進行分析，為番茄HDACs家族基因的功能分析提供基礎信息，也為分子植物育種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄測序品種‘Heinz 1706種植于廣東省農業科學院蔬菜研究所溫室，在營養生長階段取根、莖、葉，生殖生長階段取花和成熟果實；選取‘Heinz 1706生長飽滿的種子，播種于1/2 MS培養基置于光照培養箱培養，生長溫度為28 ℃，光照3 000 lx，12 h的黑暗和光照，相對濕度75%，待種子萌發后移栽至1/2MS固體培養基，培養2周。選取生長一致幼苗各30株進行脅迫處理。鹽處理：將幼苗置于200 mmol/L NaCl溶液中；ABA處理：將幼苗置于10 mol/L ABA溶液中；SA處理：將5 mmol/L SA噴灑植株葉面；42 ℃高溫處理：將幼苗置于光照培養箱培養，溫度為42 ℃，光照3 000 lx，相對濕度75%；4 ℃低溫處理：將幼苗置于人工氣候室，溫度為4 ℃，光照3 000 lx，相對濕度75%；青枯菌接種參照蘇慧慧等[22]方法，以上處理重復3次，樣品分別于0、1、2、8 h取樣，用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 番茄HDACs家族基因序列檢索和鑒定 根據擬南芥中已經鑒定出來的HDACs基因及其編碼的蛋白質序列[23]，利用Hmmer3.1b1軟件構建隱馬氏模型序列，對從SOL[23]（SGN， http：//solgenomics.net， release v2.40）下載的番茄（Solannum lycopericum L.）蛋白數據進行檢索和去冗余，得到候選蛋白序列。利用Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml）[24]和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）[25]對候選基因的氨基酸序列結構域進行鑒定，凡是含有HDACs基因保守結構域的蛋白即為番茄HDACs成員。在番茄基因組數據庫SOL中查出了所有HDACs基因的開放閱讀框長度、染色體位置、內含子個數等基本信息。利用在線工具Expasy（http：//web.expasy.org/compute_pi/）進行等電點分析，利用PSORT（http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html）[26]對番茄HDACs基因成員的亞細胞定位進行了分析。

1.2.2 番茄HDACs的分類和染色體定位分析 利用Clustal X2.1軟件[27]，對番茄和擬南芥HDACs成員進行多重序列比對，基于比對結果和擬南芥HDACs的分類依據，進行番茄HDACs的分類。

根據檢索到的番茄HDACs基因組信息，利用番茄基因組數據（SGN，http：//solgenomics.net，release v2.40），對番茄HDACs基因進行染色體定位分析。

1.2.3 番茄HDACs蛋白系統發生分析 從TAIR10（http：//www.arabidopsis.org）數據庫中下載擬南芥的HDACs蛋白全長序列，將候選番茄HDACs家族蛋白序列與擬南芥蛋白序列用Clustal X2.1軟件進行多重匹配分析，基于比對結果，參照相關文件[28]，利用MEGA5.05采用相鄰連接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育樹，并對構建的樹進行自檢（bootstrap），重復設定為1 000。

1.2.4 HDACs基因的表達分析 采用Trizol（Invitrogen）法提取總RNA，經DNaseI處理去除基因組DNA，3 g RNA經M-MLV（Rnase H-）反轉錄合成第1鏈cDNA，稀釋后做模板。根據番茄數據庫基因序列，利用Oligo 6.0設計引物（表1），由英濰捷基（上海）生物公司合成。HDACs組織表達利用熒光實時定量PCR反應試劑盒為SYBR Green Realtime PCR Master mix（Takara，大連），反應體系為SYBR Premix Ex TaqTM II（TliRNaseH Plus）（2×）10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，無菌雙蒸餾水6.4 μL，反應總體積20.0 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，40個循環；融解曲線分析95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s。采用2-△△Ct方法計算基因表達相對量，每個基因的表達反應重復3次，以Actin2作為內參基因。利用Roche Light Cycler 480軟件根據PCR擴增曲線計算實時熒光定量PCR的擴增效率。

HDACs氧化脅迫采用半定量PCR反應。反應體系：10×PCR buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6 μL，上下游引物（表2）（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA模板視濃度而定，最后添加ddH2O至總體積20 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，Tm（不同基因不同退貨溫度）退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；2 ℃延伸10 min，16 ℃無限延伸。采用瓊脂糖凝膠法進行檢測，以Actin1作為內參基因。

2 結果與分析

2.1 番茄HDACs家族基因鑒定

在番茄基因組數據庫SGN v2.40對番茄HDACs家族基因進行鑒定，結合Pfam和SMART在線分析結構域，共得到15個含有HDACs結構域的HDACs蛋白序列（表3）。其中番茄HDACs氨基酸長度為205～648，分子量為22.10～72.84 ku。根據其發育進行樹將其分為3個亞家族：RPD3/HDA1、SIR2、HD2，其中10個HDACs屬于RPD3/HDA1亞家族成員，3個屬于HD2亞家族成員，2個屬于SIR2亞家族成員。亞細胞定位發現番茄中HDACs家族基因在細胞中多數成員定位在細胞核內，也有少部分定位在葉綠體、過氧化物酶和細胞質內。其中，SIR2亞家族的基因定位在細胞核內，這15個基因在染色體上分布不均勻（表3），在3號染色體上有3個基因分布，分別為SlHDA2、SlHDA8和 SlHDA9；SlHDA7和SlHDA10分布于2號染色體上；SlHDA3和SlHDA6分布在6號染色體上；SlHDT2和SlSRT1存在于10號染色體上；另外，SlSRT1在4號染色體上，SlSRT2在7號染色體上，SlHDA5在8號染色體上，SlHDT1在9號上，SlHDA5存在于12號染色體上。

由番茄和擬南芥HDACs家族系統進化分析結果表明：相同類型的HDACs在進化圖中相離很近，如HD2亞家族中的SlHDT1、SlHDT2、AtHDT1和AtHDT2，同樣，SIR亞家族的SlSTR1、SlSRT2、AtSRT1和AtSRT2相離較近（圖1）。

2.2 番茄HDACs家族基因組織表達分析

番茄HDACs基因組織表達分析見圖2所示。結果表明：15個基因在各個組織中均有表達且具有組織表達特異性，其中，除了SlHDA9基因，其余HDACs家族基因在根組織中有較強的表達，尤其是SlHDA1、SlHDA3、SlHDA2、SlSRT1和SlHDA5表達非常強；而SlHDA1和SlHDA2在果實發育過程中表達最高，SlHDA5、SlHDA8和SlHDA9在果實發育過程中表達較高，而SlHDA4和SLHDA10在果實中表達較低；HD2亞家族的3個成員（SlHDT1、SlHDT2、SlHDT3）在根中的表達比其它組織高。SIR2亞家族的2個成員在根和花組織中表達較高。

2.3 番茄HDACs家族基因脅迫條件下的表達分析

番茄HDACs家族基因對脅迫的響應見圖3所示。結果發現，在ABA處理條件下，HDACs家族基因具有不同的表達模式，其中，SlHDA2、SlHDA3、SlHDA4、SLHDA5、SlHDA7、SlHDA9和SlHDT1、SlHDT3持續上調表達；而SlHDA1、SlHDT2和SlSRT1表達下調。在鹽處理條件下，SlHDA1、SlHDA3、SlHDA9、SlHDT3、SlSRT1上調表達；SlHDA4、 SlHDT1下調表達。在SA處理條件下，SlHDA3、SlHDA5、SlHDT2、SlHDT3表達上調；SlHDA8、SlHDT1和SlSRT1下調表達。高溫處理和低溫處理條件下，基因表達趨勢相反，高溫下調，低溫上調。

為進一步研究番茄HDACs家族基因功能，用RT-PCR（圖4）對番茄HDACs家族基因接種青枯菌后的表達差異進行分析。從圖4中可知，番茄品種1 706接種青枯菌后在0、1、2 h短時間處理后，基因SlHDA3、SlHDA7、SlHDT2表達上調，而基因SlHDA8、SlHDT3、SlSRT1表達下調；番茄Henz1706接種青枯菌后在0、1、3、10 d，基因SlHDA5和SlHDT1上調表達，基因SlHDA3、SlHDA7和SlHDT2下調表達；需要指出的是基因SlHDA7、SlHDT2，在短時間處理內，前者表達上調，后者下調，但在長時間處理后，基因表達情況相反。

3 討論與結論

組蛋白乙酰化和去乙酰化在植物生長發育和逆境脅迫響應方面發揮重要作用[30]。國內外學者在模式植物如擬南芥、玉米、水稻、大麥、葡萄和番茄等組蛋白乙酰化基因家族和基因功能方面開展了大量研究[3，31]。隨著番茄基因組計劃的完成[23]，從全基因組層面鑒定和研究基因家族的分類、進化特征和功能預測是番茄功能基因研究的熱點。本研究通過對番茄基因組組蛋白去乙酰化家族成員開展生物信息學分析，發現番茄基因組含有15個HDAC成員，分屬于3個亞家族，且分布在8條染色體上；并對其蛋白進化關系、保守結構域、基序開展分析。在番茄HDACs家族基因研究方面，Aiese等[17]在番茄基因組中找到14個成員，其中RPD3/HDA1亞家族有9個成員，本研究與盧晶霞[18-19]和Zhao等[20]研究結果一致，發現番茄HDACs有15個成員且RPD3/HDA1有10個成員。

在組織表達研究方面，Aiese等[17]通過表達譜芯片分析了HDACs在果實發育過程中的表達模式，發現SlHDA9與擬南芥AtHDA5和AtHDA18表達模式相似，在根中表達較強，SlHDA5、SlHDA6和SlHDA7在果實1 cm到破熟期10 d的表達較高；SlHDA1和SlHDA3與擬南芥AtHDA6和AtHDA19氨基酸序列相似性較高在破熟10 d與成熟期表達較強，擬南芥AtHDA6和AtHDA19基因在花發育，配子發育和其它生物學過程中具有重要功能[31]；SlSRT1主要在芽和1 cm果實大小表達較高，而SlSRT2在花和破熟10 d表達較高。SlHDT1和SlHDT2在果實1 cm和3 cm表達較強，而SlHDT3在果實3 cm和綠熟期表達較強。盧晶霞[18-19]與Zhao等[20]利用熒光定量PCR對15個HDACs家族基因開展組織表達分析發現：SlHDA1、SlHDA3和SlHDA4在花中表達較高而在果實發育過程中表達較低；SlHDA5在花和10 d的果實中表達較高而在果實發育和成熟期表達較低；SlHDA6在紅熟期表達較高而在葉片、花和果實中表達較低；SlHDA7、SlHDA9和 SlHDA10在子葉、真葉和第五周葉子中均有高水平的表達；SlHDA8特異性的在授粉后10 d的果實中有較高水平的表達；SlHDT1和SlHDT3在根和下胚軸表達較高，SlSRT1和SlSRT2在真葉、花和花后10 d的果實表達較高。本研究結果表明，SlHDT1、SlHDT2和SlHDT3在根中表達較高，而SlHDA1、SlHDA3、SlHDA5、SlHDA6在果實發育過程中表達較高，SRI2的，2個成員在花中表達較高，以上結果與前人的研究結果基本一致，表明番茄HDACs家族成員在番茄不同生長發育階段起著不同作用。

組蛋白去乙酰化酶在環境壓力應答過程中扮演重要的角色[29]。Alinsug等[32]在利用擬南芥芯片數據分析結果表明：在鹽脅迫處理條件下，AtHDA2、AtHDA6和AtHDA14表達上調，AtHDA5和AtHDA7表達下調；高溫處理條件下，AtHDA5、AtHDA6、AtHDA7、AtHDA8和AtHDA14上調表達，AtHDA9顯著下調表達；低溫條件下，AtHDA18和AtHDA19顯著上調表達，AtHDA2、AtHDA5、AtHDA6、AtHDA7、AtHDA8、AtHDA9和AtHDA14顯著下調表達；在激素處理條件下，AtHDA7和AtHDA9受ABA和SA誘導下調表達，AtHDA5和AtHDA18受SA誘導顯著上調；在生物脅迫研究方面，AtHDA6受線蟲侵染顯著表達上調，而在丁香假單胞菌則顯著下調表達。后續有研究結果表明，擬南芥AtHDA6參與長期冷脅迫相關基因的調控且在抗冷脅迫累積響應中發揮重要功能，與野生型相比在冷脅迫效應累積的hda6突變體中，表現出抗冷脅迫效應增強現象[33]；AtHDA7、AtSin3和AtHDA19三者組成轉錄抑制復合體，參與調控ABA和非生物脅迫響應[34]。本研究結果發現：SlHDA1、SlHDA3、SlHDA9和SlSRT1受鹽脅迫上調表達，SlHDA4和SlHDT1下調表達；大多數番茄HDACs基因受高溫誘導下調表達，低溫上調表達；ABA處理條件下，SlHDA5、SlHDA7、SlHDT3上調表達，SlHDA1、SlHDA3、SlSRT1下調表達；SA處理條件下，SlHDA3、SlHDA5、SlHDT2、SlHDA3上調表達，SlHDA8、SlHDT1和SlSRT1下調表達；在青枯菌短時間（2 h）處理條件下，SlHDA3、SlHDA7和SlSRT1持續上調表達；SlHDA1、SlHDT1、SlHDT3和SlSRT1則是明顯下調表達，而在青枯菌長時間（10 d）處理條件下，SlHDA5、SlHDT1、SlHDT3持續上調表達。綜合結果表明，番茄組蛋白去乙酰化家族基因在生物和非生物脅迫條件下具有重要作用。

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