尖孢鐮刀菌致病性菌株遺傳多樣性的ISSR分析

肖榮鳳　陳燕萍　朱育菁　詹洪　劉波　葛慈斌

摘 要 致病性尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種世界性分布的作物土傳病原真菌，為明確其不同寄主及專化型菌株遺傳差異性和親緣關系，利用ISSR分子標記技術對來源于不同寄主（專化型）及地理分布的43個菌株進行了遺傳多樣性分析。結果表明，供試的15條引物通過ISSR-PCR 擴增，共擴增出147條條帶，其中多態性條帶為144條，平均多態性條帶達98.0%。43個菌株的聚類結果表明，各菌株間的遺傳相似系數為0.67～0.97，且遺傳多樣性與其寄主和地理來源沒有明顯的相關性。進一步將供試菌株中葫蘆科與茄科作物尖孢鐮刀菌分別進行聚類分析，當遺傳相似系數為0.84時，16個葫蘆科的菌株可分為6個ISSR類群；當遺傳相似系數為0.77時，16個茄科的菌株亦可分為6個ISSR類群；且均表現為相同寄主或專化型菌株因地理來源不同，被歸屬于不同的ISSR類群，說明寄主或專化型相同的菌株與地理來源存在一定的相關性。

關鍵詞 尖孢鐮刀菌；專化型；ISSR-PCR；遺傳多樣性

中圖分類號 S43；Q78 文獻標識碼 A

Abstract Pathogenic Fusarium oxysporum is one of the most common soil-borne fungal pathogens all over the world. To specify genetic difference and phylogenetic relationship of F. oxysporum strains，the genetic diversity of 43 strains with different host and geographic origin or formae speciales strains was analyzed using the ISSR-PCR molecular marker technique. The results showed that 147 fragments were amplified from 43 strains by 15 tested primers. Among them， the polymorphic band was 144，which accounted for 98.0% in the total amplified fragments. The ISSR analysis showed that genetic similarity coefficient was 0.67-0.97， suggesting a high genetic variability within 43 strains. However， the results did not reveal a clear relationship between variability and the host/geographic origin. The isolates from cucurbitaceae and solanaceae crops were further performed the cluster analyses of genetic variability， respectively. At the level of 0.84，16 isolates from cucurbitaceae crops could be obviously divided into six ISSR groups. At the level of 0.77， 16 isolates from solanaceae crops could be also obviously divided into six ISSR groups. Moreover， these F. oxysporum isolates from the same host or formae speciales strains could be divided into different ISSR groups due to their different geographic origin. The results indicated that there was a relationship in a certain degree between variability and geographic origin within the isolates from the same hosts or the same formae speciales strains.

Key words Fusarium oxysporum；Formae speciales；ISSR-PCR；Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.014

由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的作物枯萎病是一種世界性分布的土傳病害，也是造成作物連作障礙的主要原因之一。該病菌可危害各種作物，一般造成20%～30%產量損失，嚴重者可導致絕收[1-4]。該病原菌在遺傳上十分復雜，且極易發生變異，導致菌株間的差異較大，僅靠傳統的形態學分類和致病性檢測進行種間及種內鑒定，難以準確揭示物種的進化關系。目前，ISSR分子遺傳標記技術由于其穩定性和重復性較好、操作簡單快速、所需DNA量少、不需要活體材料、也沒有組織特異性等特點[5-6]，在多種植物病原菌的遺傳多樣性研究中得到應用[7-10]。

在尖孢鐮刀菌的研究方面，相關的ISSR遺傳多樣性研究表明其與寄主、地理來源和毒力等方面可能存在一定的相關性。段會軍等[11]研究發現河北省西瓜枯萎病菌的ISSR遺傳多樣性與生理小種之間存在一定相關性，但與菌株的地理來源無相關性。María等[12]分析了來自不同國家的梨孢鐮刀菌的ISSR遺傳多樣性，結果表明ISSR類群與寄主和地理來源無明顯相關性。苑琳等[13]對尖孢鐮刀菌胡麻專化型的分析表明，ISSR多樣性與地理來源存在相關性。劉東等[14]研究發現尖孢鐮刀菌黃瓜專化型菌株ISSR的遺傳多樣性與菌株地理來源及毒力存在相關性。王建明等[15]和李新鳳等[16]的研究表明，尖孢鐮刀菌同一類群中菌株之間的遺傳相似性與地理來源存在一定的相關性。張述義等[17]研究表明，不同寄主的尖孢鐮刀菌的ISSR 類群劃分與菌株的地理來源沒有明顯的相關性，但分離自相同寄主的各菌株間的遺傳相似性與菌株的地理來源有一定的相關性。上述相關研究表明，尖孢鐮刀菌的遺傳變異存在復雜性和多樣性，不同寄主與地理來源的菌株在遺傳變異上存在較大差異性，可能與菌株進化過程中受自然環境條件影響及與寄主發生協同進化等因素有關，而且菌株的遺傳變異也可能引發寄主植物抗性的改變，從而影響該病害的防治。因此，研究不同寄主尖孢鐮刀菌的遺傳多樣性對該病原菌的種系演化和病害防治具有重要的意義。但目前如番茄、辣椒、甜瓜和苦瓜等作物尖孢鐮刀菌ISSR的遺傳多樣性還未見報道，本研究收集了不同寄主（專化型）和地理來源的尖孢鐮刀菌43株，擬采用ISSR-PCR技術進行遺傳多樣性研究，旨在探討這些菌株的遺傳多樣性與寄主或專化型、地理分布的關系，為尖孢鐮刀菌的遺傳分化、系統發育和病害防治等領域的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌不同專化型菌株共43株（表1）。除菌株FJAT-282、FJAT-9394和FJAT-3322分別為浙江大學、河北省農林科學院和中國熱帶農業科學院贈送外，余者均由本研究室從福建省內不同地區采集與分離保存。

培養基：PDA、PDB。

試劑：10 mmol/μL dNTPs、10×Buffer（無Mg2+）、25 mmol/μL MgCl2和5 U/μL Taq酶購自上海博尚生物技術服務有限公司；用于ISSR-PCR 反應的15條ISSR引物參考王建明等文獻[15]，來自于英國哥倫比亞大學（University of British Columbia）公布的序列（表2），引物均由上海博尚生物技術服務有限公司合成。

儀器：Gel Doc-ItTM UVP凝膠成像系統；Biometra PCR儀；BIO-RAD PowerPacTM Basic電泳儀；Thermo Scientific NanoDrop 2000C分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 尖孢鐮刀菌菌絲培養及DNA提取 將供試的43株尖孢鐮刀菌菌株經PDA平板活化后，分別接種到PDB培養液中，25 ℃恒溫振蕩培養7 d，過濾獲得菌絲，烘干備用。菌株DNA提取方法參考蘇明星等[18]方法。制備好的DNA采用Thermo Scientific NanoDrop 2000C 分光光度計測定DNA的濃度，用滅菌的去離子水將DNA濃度統一調節成20 ng/μL，備用。

1.2.2 尖孢鐮刀菌的ISSR引物篩選與擴增 ISSR 擴增反應體系參考文獻[15，19]。20 μL的PCR反應體積：1.0 U Taq DNA聚合酶，1.2 μL MgCl2（25 mmol/μL），dNTPs 0.3 μL（10 mmol/μL），0.8 μL引物（10 μmol/μL），1 μL模板DNA（20 ng/μL）。PCR循環參數：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃/54 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共35個循環；72 ℃ 7 min。

隨機選取3個來自不同寄主的菌株基因組DNA為模板，利用合成的15條ISSR引物對其進行擴增，然后比較擴增結果，從中選擇多態性和重復性好的引物對43 株供試菌株的基因組進行PCR 擴增。擴增反應結束后，在2%瓊脂糖凝膠中分離擴增產物并拍照。

1.2.3 尖孢鐮刀菌的ISSR-PCR多態性分析 ISSR引物的PCR擴增產物經電泳分離后，記錄每條引物對每個菌株的DNA的擴增結果。在電泳圖譜中每條擴增條帶都代表引物與模板DNA互補的一對結合位點，可記為1個分子標記。采用Gel-Pro Analyzer軟件對ISSR電泳圖譜中的條帶進行自動識別和記錄，并進行人工校對。將PCR擴增的DNA條帶轉換成0/1矩陣，無帶的記為0，有帶的記為1，得到ISSR分子標記的原始0/1二元數據矩陣。利用NTSYSpc（Version 2.10e）軟件進行數據處理，應用SIMQUAL（Similarity for Qualitative Date）法進行菌株間的遺傳相似系數計算，以非加權類平均法（UPGMA）進行聚類分析并構建系統聚類圖。

2 結果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌的ISSR引物的篩選與擴增

15條ISSR引物對43株尖孢鐮刀菌的擴增結果表明（表2），所有引物均具背景清晰、信號強、多態性明顯的特點，部分擴增結果圖片見圖1。共擴增出147條條帶，多分布在500～2 000 bp之間，其中特征性條帶（多態性位點）為144條，多態性平均比例為98%。不同引物擴增條帶數不等，條帶數在5～15條之間，多數為9～11條之間，平均每條引物產生多態性條帶9.8條。因此供試的15條引物均可用于供試的不同寄主的尖孢鐮刀菌遺傳多態性分析。

2.2 不同寄主專化型尖孢鐮刀菌的ISSR-PCR多態性分析

對43株來自8個不同寄主或專化型尖孢鐮刀菌的ISSR-PCR擴增，聚類分析結果表明（圖2）：各菌株間的遺傳相似系數為0.67～0.97，且遺傳多樣性與其寄主和地理來源沒有明顯的相關性。有些寄主或地理來源相同的菌株間的遺傳距離比寄主或地理來源不同的菌株間的遺傳距離大，有些則相反。如1號菌（來自浙江）與同寄主專化型的2～5號菌株（均來自福州市閩侯縣）遺傳距離相差較大；而34號分離自花生的菌株（來自泉州市惠安縣）與17～18號分離自苦瓜專化型（福州市閩候縣）遺傳距離較近。但專化型（寄主）和地理來源相同的菌株卻有優先聚到一起的趨勢，如番茄專化型菌株2～5號（均來自福州市閩侯縣）、茄專化型菌株13～16號（均來自廈門市同安區）和香蕉古巴專化型22～25號（均來自漳州市南靖縣）。

為進一步分析這些尖孢鐮刀菌的ISSR-PCR多態性及遺傳相似性，從中將寄主為葫蘆科和茄科作物的尖孢鐮刀菌菌株分別進行聚類分析。

葫蘆科作物尖孢鐮刀菌的聚類分析結果表明（圖3），16株菌株遺傳相似系數在0.62～0.97之間。當遺傳相似系數為0.84時，供試的16株尖孢鐮刀菌可明顯地分成6個ISSR類群（ISSR Groups，IGs）：甜瓜專化型菌株可分為3個IGs，IGsⅠ為7～9號菌（均來自福州市閩侯縣）、IGsⅤ為10號菌（來自寧德市古田縣）和IGsⅥ為11株號（來自福州市永泰縣），苦瓜專化型菌株均歸為IGsⅡ（17～21號菌，來自福州市閩侯縣）；西瓜專化型菌株分為2個IGs，IGsⅢ為28、29號菌、31～33號菌（均來自福州市永泰縣）和IGsⅣ為30號菌（來自福清市漁溪鎮）。上述結果表明，相同寄主專化型菌株因地理來源不同，遺傳相似距離較大，親緣關系較遠；相同寄主專化型且地理來源相同的菌株，遺傳相似距離較小，親緣關系較近。

茄科作物尖孢鐮刀菌的聚類分析結果表明（圖4），16株菌株遺傳相似系數在0.62～0.94之間。當遺傳相似系數為0.77時，供試的16株尖孢鐮刀菌可明顯地分成6個ISSR類群：番茄專化型菌株可分為2個IGs，IGsⅠ為1號菌（來自浙江），IGsⅡ為2～6號菌（分別來自福州市閩侯縣和河北保定）；寄主為辣椒的萎蔫專化型可分為3個IGs，IGsⅢ為40號菌株（來自莆田市荔城區），IGsⅣ為41～43號菌（來自漳州市平和縣），IGsⅥ為39號菌（來自福清市漁溪鎮）；茄專化型13～16號菌株歸為IGsⅤ（均來自廈門市同安區），但12號茄專化型菌株（來自漳州平和縣）例外，與番茄專化型菌株歸為IGsⅡ。上述結果同樣表明，相同寄主專化型菌株因地理來源不同，遺傳相似距離較大，親緣關系較遠；相同寄主專化型且地理來源相同的菌株，遺傳相似距離較小，親緣關系較近；但個別菌株出現例外。

3 討論與結論

ISSR分子標記通常為顯性標記，具有很好的穩定性和多態性[20]。本研究對43個尖孢鐮刀菌菌株進行ISSR-PCR擴增，供試的15條引物均具有良好的多態性，且平均多態性條帶達98.0%，說明供試菌株的DNA 基因組在SSR區域的遺傳差異明顯、多態性高，所篩選的引物可用于ISSR-PCR擴增進行尖孢鐮刀菌種內遺傳差異分析，該結果與段會軍等[11]和王建明等[15]的結果一致。

不同寄主與地理來源尖孢鐮刀菌的遺傳變異存在復雜性和多樣性，影響著該病原菌的種系演化和病害防治，明確其遺傳變異具有重要的意義。本研究對43株來自于不同寄主或專化型尖孢鐮刀菌的ISSR-PCR遺傳多態性分析結果表明，各專化型菌株間的遺傳相似系數與其寄主和地理來源沒有明顯的相關性。有些寄主或地理來源相同的菌株間的遺傳相似系數比寄主或地理來源不同的各菌株間的遺傳相似系數大，有些則相反。說明不同專化型類群菌株中，當寄主差異較大時，利用ISSR-PCR遺傳多態性分析并不能很好的反映菌株與寄主或地理來源的相關性，但寄主和地理來源相同的菌株卻有優先聚到一起的趨勢，該結果與張述義等[17]的研究結果一致。通過進一步將供試菌株進行細化分類重新聚類分析，發現葫蘆科與茄科作物尖孢鐮刀菌ISSR-PCR遺傳多態性結果均表明，相同寄主專化型菌株因地理來源不同，遺傳相似距離較大，親緣關系較遠；相同寄主專化型且地理來源相同的菌株，遺傳相似距離較小，親緣關系較近；但有個別菌株會出現例外。該結果可說明在同一類群中不同菌株之間的遺傳相似性與菌株的地理來源有一定的相關性，與王建明等[15]的結果有相似性，而且其認為簡單地提出分子類群與菌株的地理來源沒有相關性是不準確的。Bentley等[21]研究表明，鐮刀菌在很小的地理隔離就有多樣性，甚至在間隔l m的種植行種系就出現明顯的差異。本研究中如甜瓜專化型和萎蔫專化型菌株雖然均來自福建省內，因地理來源于不同市縣，均分別歸屬于不同的ISSR類群，說明不同專化型菌株在遺傳變異上有豐富的多樣性，同時在相似種群內（均來自葫蘆科或茄科）與地理和寄主來源存在一定相關性，這對后續田間作物品種種植的合理布局與病原菌的遺傳變異監測具有重要的理論指導，通過對田間菌株的遺傳多樣性監測，進行作物的輪作、間作和病害防治指導，以減輕病害的發生。此外，本研究中由于供試菌株數量有限，可能導致結果存在一定的局限性。因此，下一步的研究還待收集更多來源廣泛的菌株，并對特定的某種專化型菌種進行種下的遺傳多態性研究。

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