流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)三陰性乳腺癌的生物學(xué)意義

張景臣1（通訊作者） 劉 薇1 毛大華2

【摘 要】目的：S期細(xì)胞比率（S-Phase Fraction SPF）、倍體表達(dá)在三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌之間有無(wú)差別；方法：通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)135例乳腺SPF及倍體表達(dá)情況。結(jié)果：19例三陰性乳腺癌中SPF：9.32±4.89；116例非三陰性乳腺癌SPF：5.65±4.14；三陰性乳腺癌中二倍體6例、異倍體13例，非三陰性乳腺癌二倍體49例、異倍體67例；結(jié)論：三陰性乳腺癌的SPF值較非三陰性乳腺癌差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而倍體表達(dá)無(wú)明顯差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；高表達(dá)的SPF與年齡、臨床分期有明顯相關(guān)性，而與淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移、腫塊大小無(wú)明顯相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】三陰性乳腺癌；流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)；S期細(xì)胞比率 倍體表達(dá)

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）均為陰性的乳腺癌亞群。TNBC為預(yù)后最差的乳腺癌亞型，具有侵襲性強(qiáng)，惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]，除化療外尚無(wú)有效地全身治療措施，依靠現(xiàn)有的臨床和病理指標(biāo)難以對(duì)三陰性乳腺癌患者進(jìn)行最優(yōu)化的個(gè)體化治療和預(yù)后分析。

受體檢測(cè)和陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn) ER、PR受體采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，陽(yáng)性細(xì)胞比例≥1%判定為陽(yáng)性。HER-2受體采用免疫組化與免疫熒光原位雜交（FISH）相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為：①免疫組織化學(xué)檢測(cè)“+++”定義為陽(yáng)性，“—”和“+”定義為陰性。②免疫組織化學(xué)檢測(cè)“++”必須經(jīng)FISH檢測(cè)再次確定：若FISH（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）為陽(yáng)性則定義為HER-2受體陽(yáng)性，若FISH為陰性則定義HER-2受體陰性。③免疫組織化學(xué)檢測(cè)為“+++”或FISH檢測(cè)陽(yáng)性，兩者之一陽(yáng)性即可定義HER-2受體陽(yáng)性。

流式細(xì)胞檢查（flow cytometry，F(xiàn)CM）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的對(duì)單細(xì)胞定量分析的一種新技術(shù)，它采用計(jì)算機(jī)、激光和熒光標(biāo)記單克隆抗體技術(shù)，能在短期內(nèi)對(duì)大量標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，具有極高的檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)精確性。而且從單一細(xì)胞可以同時(shí)測(cè)得多個(gè)參數(shù)，為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗(yàn)提供了一個(gè)全新視角和強(qiáng)有力的手段。經(jīng)FCM檢測(cè)后一般能獲得三項(xiàng)參數(shù)：DNA倍體數(shù)（ploidy）、DNA指數(shù)（DNA Index DI）和細(xì)胞群體中進(jìn)行DNA合成的增殖細(xì)胞的百分比（S-phase fraction，SPF）。DNA倍體是細(xì)胞核中重要遺傳物質(zhì)DNA含量的一個(gè)客觀指標(biāo)，腫瘤細(xì)胞的無(wú)限制分裂、增殖與細(xì)胞核中DNA含量變化密切相關(guān)。DNA倍體是組織細(xì)胞的基本生物學(xué)特性之一。腫瘤細(xì)胞DNA倍體變化不僅對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要理論意義，而且對(duì)腫瘤的診斷、鑒別診斷、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤治療和預(yù)后判斷也有一定的臨床意義[2]。S期指數(shù)是一項(xiàng)檢測(cè)DNA合成的增殖細(xì)胞百分比的指標(biāo)，能較準(zhǔn)確地計(jì)算處于增殖期的細(xì)胞比例，而腫瘤增殖強(qiáng)弱能體現(xiàn)其侵襲性。

1.研究對(duì)象：回顧性分析2010年1月～2013年1月鄭州人民醫(yī)院乳腺外科收治的乳腺癌病例，組織來(lái)源新鮮乳腺癌癌組織，在臨床工作中快速冰凍病理確診的乳腺癌，留取的癌灶組織；入選的乳腺癌病例，均為女性，全組135例乳腺癌，LumunalA型占52.6%（71/135），Luminal B型占24.4%（33/135），HER-2過(guò)表達(dá)型占8.9%（12/135），三陰性型占14.1%（19/135），大于等于50歲有52例，小于50歲有83例，平均年齡47.6歲，中位年齡48歲；按1997年UICC TNM分期，III期21例，II期94例，I期20例；腫瘤≤2cm 21例，2cm< ≤5cm 92例，>5cm 22例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例。

2.研究方法

2.1 主要試劑

美國(guó)BD公司Ccycle TESTTMPLVS DNA Rent Kit試劑盒，磷酸緩沖液（PBS），A液（trysin buffer），B液（trysin inhibitor and RNase buffer），C液（propidium iodide stain solution）。

2.2 檢測(cè)方法

2.2.1 單細(xì)胞懸液樣品的制備

將新鮮病灶組織50-100mg剪碎或蠟塊組織去蠟后剪碎，同時(shí)用PH值為7.4的磷酸緩沖液（PBS）緩滴，用300目濾膜過(guò)濾，得到的單細(xì)胞倒入試管內(nèi)離心（1000轉(zhuǎn)/分，5分鐘）；棄去上清液后，待檢。

2.2.2 DNA含量及倍體檢測(cè)的樣品制備

應(yīng)用BD公司Ccycle TESTTMPLVS DNA Rent Kit試劑盒，PI染色法制備樣本；①在每個(gè)細(xì)胞懸液試管中加入250μl A液（trysin buffer），手輕叩試管（流式細(xì)胞術(shù)專用試管）使充分混合，放置10分鐘；②在每個(gè)加入A液試管中再加入200μl B液（trysin inhibitor and RNase buffer），手輕叩試管使充分混合，放置10分鐘；③在每個(gè)已經(jīng)加入A、B液試管中再加入200μl 冷的（2℃～8℃）C液（propidium iodide stain solution）手輕叩試管使充分混合，在2℃～8℃冰箱內(nèi)避光放置30分鐘，即可上機(jī)檢測(cè)。

2.2.3 主要儀器及校正

流式細(xì)胞檢測(cè)采用美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀FACSCalibur，激發(fā)光源為2W氬離子激光器，輸出功率300W，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，分別進(jìn)行單參數(shù)檢測(cè)。上機(jī)前先以標(biāo)準(zhǔn)微球調(diào)整儀器，使CV<2%，DNA含量檢測(cè)前先做BD公司DNA質(zhì)控下載質(zhì)控條件檢測(cè)樣品DNA。DNA含量檢測(cè)以線性方式采集數(shù)據(jù)。DNA數(shù)據(jù)采用機(jī)載軟件分析。

3.研究結(jié)果：

表1：基線期三陰性與非三陰性臨床病理參數(shù)比較：

臨床病理參數(shù) 三陰性 非三陰性 x2 P值

年齡 0..26 0.871

<50歲 12 71

≥50歲 7 45

月經(jīng)狀況 0.356 0.551

絕經(jīng)前 15 84

絕經(jīng)后 4 32

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 0.407 0.523

有 8 58

無(wú) 11 58

臨床分期 2.053 0.358

I期 2 18

II期 12 82

III期 5 16

腫塊大小 0.667 0.717

≤2cm 2 19

2cm< ≤5cm 13 79

>5cm 4 18

三陰性與非三陰性乳腺癌病理參數(shù)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；

表2：三陰性與非三陰性流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果：

三陰性 非三陰性 P值

S期細(xì)胞比率 9.32±4.89 5.65±4.14 0.01

二倍體 6 49 0.38

異倍體 13 67

SPF表達(dá)中三陰性明顯高于非三陰性，而倍體表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；

再對(duì)135例乳腺癌按年齡、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移、腫塊大小、臨床分期進(jìn)行單因素分析SPF、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

表3：?jiǎn)我蛩胤治鯯PF與臨床病理參數(shù)

臨床病理參數(shù) SPF平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 P值

年齡 0.038

<50歲 5.52±3.67

≥50歲 7.12±5.25

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 0.445

有 6.38±3.99

無(wú) 5.81±4.72

臨床分期 0.00

I期 5.09±4.87

II期 6.18±4.48

III期 6.83±3.83

腫塊大小 0.546

≤2cm 5.62±4.54

2cm< ≤5cm 6.29±4.62

>5cm 6.62±3.96

4.討論：

SPF高者細(xì)胞增生活躍，預(yù)后較差[3]。Charlotte R wenger等[4]總結(jié)了273篇有關(guān)乳腺癌SPF研究文獻(xiàn)指出，SPF與其他乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)有明顯的相關(guān)性，。SPF較高患者生存率較短。SPF可以反映乳腺癌的增殖活性和侵襲能力。另外，ER陽(yáng)性者SPF較低而ER陰性者SPF較高是因?yàn)槿橄僦掳┖罂墒ズ铣蒃R的能力，ER表達(dá)有賴于細(xì)胞分化，與增殖呈負(fù)相關(guān)，這也比較合理地解釋了ER陽(yáng)性患者乳腺癌患者預(yù)后較好的原因。高SPF與年齡因素有關(guān)，本研究中大于等于50歲SPF：7.12±5.25與小于50歲SPF：5.52±3.67比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與yuan ZY，Wang SS，等TNBC占全部乳腺癌的10%～20%，多見(jiàn)于絕經(jīng)前的女性[5].的研究結(jié)果不同，本研究中SPF與臨床分期有關(guān)，臨床分期越高，SPF值較大但與腫塊大小無(wú)明顯相關(guān)性這與Brvan BB，Schnitt SJ等研究提示：TNBC與其他類型乳腺癌相比，預(yù)后差，生存時(shí)間短，腫塊較大[6，7]；研究結(jié)論之間的差異可能與本研究標(biāo)本數(shù)量較少有關(guān)；Rakha EA，EL Sayed ME研究結(jié)果提示：高SPF腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低[8]，與本研究SPF與淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性略有不同。與non-TNBC易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不同，TNBC更易出現(xiàn)肝臟、肺部等內(nèi)臟器官轉(zhuǎn)移[9]；TNBC患者不易出現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而易出現(xiàn)遠(yuǎn)端器官肝臟、肺臟轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)跳躍轉(zhuǎn)移征象；高SPF化療敏感性較高[10]但預(yù)后較差，出現(xiàn)這種矛盾的現(xiàn)象可能TNBC這一亞型可能有其特殊的生物學(xué)行為，有待進(jìn)一步研究。

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作者單位：1.鄭州人民醫(yī)院 乳腺科（張景臣 劉薇）2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（毛大華）

通信作者：河南 鄭州 450000 張景臣，