僵蠶中總黃酮提取工藝研究

黃居敏 張亞梅 李旸 張普照 楊明

摘要 [目的]優化僵蠶中總黃酮的提取工藝，測定僵蠶中總黃酮的含量。[方法]以總黃酮含量為評價指標，采用單因素和Box-Behnken試驗設計，考察乙醇體積分數、提取時間、料液比、提取次數、藥材粒徑對僵蠶總黃酮提取效果的影響。[結果]僵蠶在體積分數90%乙醇溶液、料液比1∶15（g/ml）的條件下提取1 h的總黃酮得率最高，為1.85%。[結論]優選的總黃酮提取工藝穩定可行，建立的含量測定方法準確可靠。

關鍵詞 僵蠶總黃酮；提取工藝；含量測定

中圖分類號 R282.74 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）34-154-04

僵蠶，又名天蟲、姜蟲，是4～5齡家蠶經白僵菌感染僵化而死的干燥蟲體，具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結之功[1]。蠶以桑為食，桑葉中富含黃酮類物質，故而蠶體內含有大量黃酮類代謝產物。研究表明，蠶體內黃酮類化合物與桑葉中的黃酮類化合物在成分上存在差異，不同蠶品種間及不同發育時期所含黃酮類化合物含量也不同[2-6]。此外，蠶經白僵菌侵染后，體內化學成分在白僵菌的作用下也會發生變化。日本學者從僵蠶中分離得到經白僵菌轉化后的特有產物，其中1個為黃酮類代謝產物[7]。到目前為止，已從僵蠶中分離得到多個黃酮類化合物，如槲皮素7OβD4O甲基葡萄糖苷、山奈酚7OβD4O甲基葡萄糖苷及槲皮素、山奈酚，其中槲皮素7OβD4O甲基葡萄糖苷和山奈酚7OβD4O甲基葡萄糖苷為僵蠶特有的代謝產物[8]。筆者在此在單因素試驗的基礎上，應用響應面法對僵蠶總黃酮的提取條件進行優化，通過研究僵蠶中總黃酮提取工藝進一步指導僵蠶體內黃酮類化合物的分離及僵蠶在形成過程中黃酮類化合物的變化規律研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 僵蠶購自四川省成都荷花池中藥材市場，經江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心曹嵐副教授鑒定為僵蠶（Bombyx batryticatus）。蘆丁對照品購自中國藥品生物制品檢定所。所用試劑均為國產分析純。所用儀器為島津UV2550、電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）、數顯恒溫水浴鍋HH6（國華電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制。精密稱定干燥至恒重的蘆丁對照品11.55 mg，置50 ml容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻即得濃度為0.231 mg/ml的標準溶液。

1.2.2 樣品溶液的制備。各精密稱取僵蠶粉末4 g于100 ml圓底燒瓶中，采用90%的乙醇，按料液比1∶10（g/ml）加熱回流提取1 h，過濾，濾液用相應提取劑定容至100 ml，即得樣品溶液。

1.2.3 方法學考察。

1.2.3.1 線性關系考察。分別精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml置于10 ml試管中，各加5%NaNO2溶液1 ml，搖勻放置6 min；再加10%Al（NO3）3溶液1 ml，搖勻靜置6 min；加4%NaOH溶液4 ml，搖勻靜置15 min。以同法配制空白對照，在波長500 nm處測定吸光度值，在平行處理的條件下測定3次，求平均值，得回歸方程A=12.458 63C+0.008 17（R2=0.999 01），表明蘆丁對照品在0.023～0.069 mg/ml范圍內線性關系良好。

1.2.3.2 精密度試驗。精密吸取同一供試品溶液1 ml，按“1.2.3.1”方法連續測定6次，供試品溶液的吸光度平均值為0.474，RSD=0.4%。

1.2.3.3 穩定性試驗。精密吸取供試品溶液1份，按“1.2.3.1”方法顯色，于500 nm處測定吸光度，并每間隔5 min測定1次吸光度。結果在25 min內，吸光度平均值為0.46，RSD=2.2%，說明供試品溶液在25 min內顯色穩定。

1.2.3.4 重復性試驗。取僵蠶粉碎藥材6份，按“1.2.2”和“1.2.3.1”項下供試品溶液的制備及顯色方法處理樣品，于500 nm測定吸光度平均值為0.445，RSD=1.6%，表明該方法重復性良好。

1.2.3.5 加樣回收率試驗。精密量取已知黃酮含量的僵蠶提取液，分別加入一定量的蘆丁對照品溶液，按“1.2.3.1”方法測定，用回歸方程計算總黃酮含量，測得平均加樣回收率為100.01%（表1），RSD=2.81%，表明該法回收率良好。

1.2.4 樣品總黃酮含量測定。精密吸取樣品溶液1 ml置于10 ml試管中，按“1.2.3.1”項下“各加5%NaNO2溶液1 ml至在波長500 nm處測定吸光度值”，在平行處理的條件下測定3次，根據回歸方程計算樣品中總黃酮含量?？傸S酮含量=C×V×V0v×W×1 000×100%，式中，C為標準曲線上查出的質量濃度（mg/ml）；V為反應體積（ml）；V0為配制的溶液體積（ml）；v為取樣量（ml）；W為提取物質量（g）。

1.2.5 單因素試驗。

1.2.5.1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響。采用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比1∶10（g/ml），加熱回流提取1 h，平行3組，將濾液定容至100 ml，測定其吸光度，考察不同乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。

1.2.5.2 料液比對總黃酮含量的影響。采用料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30（g/ml），80%乙醇加熱回流提取1 h，平行3組，將濾液定容至100 ml，測定其吸光度，考察不同料液比對總黃酮提取率的影響。

1.2.5.3 提取時間對總黃酮含量的影響。采用料液比1∶10（g/ml）、80%乙醇，分別加熱回流提取0.5、1.0、1.5、2.0 h，平行3組，將濾液定容至100 ml，測定其吸光度，考察不同提取時間對總黃酮提取率的影響。

1.2.5.4 提取次數對總黃酮含量的影響。采用料液比1∶10（g/ml）、80%乙醇，分別加熱回流提取1、2、3次，每次1 h，平行3組，將濾液定容至100 ml，測定其吸光度，考察不同提取次數對總黃酮提取率的影響。

1.2.5.5 粒徑對總黃酮含量的影響。采用料液比1∶10（g/ml）、80%乙醇，分別對過2號篩、3號篩、4號篩、5號篩、6號篩的僵蠶粉末加熱回流提取1次，提取時間1 h，平行3組，濾液定容至100 ml，測定其吸光度值，考察不同粒徑對總黃酮提取率的影響。

1.2.6 響應面法優化總黃酮最佳提取工藝。根據單因素試驗結果，選取乙醇濃度、料液比、提取時間3個因素為主要考察因素，應用DesignExpert 8.0軟件，設計3因素3水平的響應面試驗（表2），利用響應面試驗結果，即取僵蠶粉末4 g，精密稱定，按BoxBehnken Design設計表中的條件進行提取，過濾后定容至100 ml容量瓶中，按“1.2.3.1”方法顯色后測定吸光度，確定僵蠶中總黃酮的最佳提取條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對僵蠶總黃酮含量的影響。由圖1可見，總黃酮含量隨乙醇濃度的升高先增加后降低，當乙醇濃度為80%時，總黃酮含量最高，故選80%乙醇為最佳提取溶劑。

2.1.2 料液比對僵蠶總黃酮含量的影響。從圖2可以看出，當料液比為1∶10（g/ml）時總黃酮含量最高，故選1∶10作為總黃酮提取的料液比。

2.1.3 提取時間對僵蠶總黃酮含量的影響。由圖3可見，在1 h時總黃酮含量最高，故選1 h作為提取時間。

2.1.4 提取次數對僵蠶總黃酮含量的影響。圖4顯示，隨著提取次數的增加，總黃酮含量變化不大，考慮到時間和經濟成本，提取1次。

2.1.5 粒徑對僵蠶總黃酮含量的影響。從圖5可看出，隨著粒徑的減小，總黃酮含量增加，但3～6號篩增幅不大，故綜合考慮選取過3號篩但不過7號篩的僵蠶粉末作為研究對象。

2.2 響應面法優化總黃酮最佳提取工藝試驗結果 通過DesignExpert 8.0軟件對響應面法試驗優化僵蠶總黃酮提取工藝的結果（表3）進行分析，發現回歸模型極其顯著（P<0.000 1），說明建立的模型有意義；失擬項P=0.739 6>0.05，無顯著性差異，說明模型擬合度良好（R2=0.972 0），表明可用此模型和方程來分析和預測僵蠶總黃酮的提取率。以僵蠶中總黃酮得率為響應值，經回歸擬合后，得到回歸方

程：總黃酮得率=1.63+0.28A+0.072B+0.10C-0.031AB+0.056AC-0.050BC-0.20A2-0.33B2-0.11C2。經檢驗，回歸模型的校正決定系數R2Adj為0.935 9，說明此模型能解釋93.59%響應值的變化，即此模型與數據擬合度較好。回歸模型系數顯著性檢驗結果顯示，模型的一次項中A（乙醇濃度）、B（提取時間）、C（料液比）均顯著，其中A影響程度最為顯著；二次項B2影響為極顯著，A2、C2顯著。由此可知，各影響因素間不是簡單的線性關系。在選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序為乙醇濃度>料液比>提取時間。

2.3 各因素間的交互作用 從響應面分析圖可形象地看出最佳參數及各參數間的相互作用，若曲線越陡，表明該因素對總黃酮得率的影響越大，相應表現為響應值變化的大?。欢傻雀呔€可以看出為橢圓形表明兩因素間交互作用較顯著。從圖6可以看出，乙醇濃度對總黃酮得率影響最大，料液比次之，與方差分析結果相吻合。

2.4 驗證試驗 通過軟件分析確定僵蠶總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度90%、料液比1∶15、提取時間1 h，此條件下計算出的總黃酮得率理論值為1.76%。依據確定的最佳提取工藝進行驗證試驗（n=5），得總黃酮平均得率為1.85%，RSD=2.13%，測定結果穩定，證明該結果合理可靠。

3 結論與討論

該試驗在單因素試驗的基礎上，應用響應面分析法優化僵蠶總黃酮的提取工藝得出：僵蠶在體積分數90%乙醇溶液、料液比1∶15（g/ml）的條件下提取1 h的總黃酮得率最高，為1.85%，與模型預測值相符。表明該法優選的總黃酮提取工藝穩定可行，建立的含量測定方法準確可靠。

僵蠶作為臨床上常用的蟲類藥材，其總黃酮的藥理活性及物質基礎研究較為薄弱，該試驗通過對總黃酮提取工藝的研究，對后續僵蠶中黃酮類化合物的分離制備及藥理學研究具有一定的指導作用。

參考文獻

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