超聲波復合酶法提取芡實多糖的工藝研究

盧美娟 邵京 張紅星 許超 凌曉君

摘要 [目的] 為芡實的深度開發與利用提供基礎理論參考。[方法]通過單因素試驗和正交試驗對超聲波協同復合酶提取芡實中多糖的工藝條件進行了優化，確定其最佳工藝參數。[結果] 芡實多糖提取的最佳工藝參數為：纖維素酶1.5%，果膠酶1.0%，酶解溫度35 ℃，復合酶處理80 min；酶解后進行超聲處理，料液比1∶10，超聲溫度60 ℃，超聲時間1.5 h。在此條件下的多糖提取率為12.38%。[結論] 該提取工藝簡單可行，對工業化生產芡實多糖具有指導意義。

關鍵詞 芡實；多糖；超聲波；復合酶

中圖分類號 S567；K284.2 文獻標識碼A 文章編號 0517-6611（2015）34-161-03

芡實（Semen eurylie）是睡蓮科水生草本植物芡（Euryale ferox Salisb.）的成熟種仁，具有益腎固精、補脾止瀉、祛濕止帶的功效，是傳統的中藥材和珍貴的天然補品[1-3]。芡實多糖是一種特有的天然活性多糖，具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、降血糖、抗氧化和清除自由基等藥理活性，具有相當高的藥用價值[4-6]。芡實中的糖脂類化合物（Glycolipid components）可以明顯改善老鼠心肌局部性貧血受損的癥狀[7-8]。

芡實質地較硬，壁厚，多糖難以擴散出來，傳統方法提取芡實多糖的提取率低[9-10]。趙建國[11]、謝燕娟[12]和宋晶[13]等采用超聲波輔助法提取芡實多糖，主要是利用其空化效應破壞植物細胞壁，從而有利于有效成分的溶出。由于植物材料的細胞壁主要由纖維素、木質素和果膠質等物質構成，纖維素酶和果膠酶等能使細胞壁疏松、破裂，減小傳質阻力，從而提高有效成分的提取效率。采用超聲波同步協同酶法提取芡實多糖的研究尚未見報道。筆者對超聲波協同復合酶提取芡實中多糖的工藝條件進行了優化，確定最佳工藝參數，旨在為芡實的深度開發利用提供了基礎理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料。芡實，市售，于60 ℃下烘干至恒重，粉碎。

1.1.2 主要試劑。無水乙醇、蒽酮、濃硫酸、無水葡萄糖對照品，以上均為分析純；纖維素酶，購自寧夏夏盛實業集團有限公司；果膠酶，購自寧夏夏盛實業集團有限公司。

1.2 試驗儀器

電熱恒溫鼓風干燥箱（型號DGG-9140A，上海森信實驗儀器有限公司）；高速萬能粉碎機

（型號FW100，天津市泰斯特儀器有限公司）；電子天平（型號JA5003N，上海精密科學儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（型號DK-S26，上海森信實驗儀器有限公司）；低溫恒溫槽（型號DJB-3010，金壇市晶玻實驗儀器廠）；超聲波細胞粉碎機（型號BILON92-IID，上海比朗儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（型號RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；紫外可見分光光度計（型號UV-1750，日本島津）；高速離心機（型號TG20-WS，長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 芡實多糖的提取工藝。芡實晾曬后于60 ℃下恒溫烘干，用粉碎機粉碎后密封保存。芡實多糖的工藝流程為：芡實→干燥粉碎→加復合酶酶解→超聲波提取→離心→上清液→減壓濃縮→醇沉→離心→冷凍干燥→粗碎、成品。

1.3.2 芡實多糖含量的測定。采用蒽酮-硫酸法測定多糖含量[14]。葡萄糖標準曲線的繪制：精確稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品26.10 mg，加入蒸餾水溶解并定容至100 ml，得到標準葡萄糖溶液（0.261 mg/ml）。精確移取標準葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和1.2 ml置于20 ml具塞試管中，加蒸餾水至2 ml，精密加入蒽酮試劑（精密稱取蒽酮0.1 g，加入80%的硫酸溶液100 ml使溶解，搖勻）6 ml，搖勻，置于沸水浴中煮沸15 min，取出，放入冰水浴中15 min，取出。以相應試劑為空白，在最大吸收波長625 nm處測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：y = 0.003 9x+0.012（R2=0.999 2）。

稱取適量芡實粉，以水為溶劑，酶解超聲提取后，于6 000 r/min離心5 min，留上清液作為供試品溶液。取供試品溶液稀釋至適當倍數后，搖勻，精確吸取2 ml置于20 ml干燥的具塞試管中，加入蒽酮試劑6 ml，按照葡萄糖標準曲線制作的方法進行操作，于625 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線查得葡萄糖濃度C（μg/ ml），計算供試品中的多糖含量。

按照以下公式計算芡實多糖的得率：多糖得率（%）=供試品中的多糖含量（g）/芡實樣品的質量（g）×100%。

1.3.3 酶解處理條件的優化。分別以不同的纖維素酶用量、果膠酶用量、酶解時間、酶解溫度為單因素，考察其對芡實多糖提取效果的影響。在單因素試驗的基礎上，以多糖得率（%）為評價指標，進行4因素3水平正交試驗，確定酶解的最優條件。酶解處理正交試驗因素及水平設計見表1。

1.3.4 超聲處理條件的優化。

以最佳酶解條件下得到的芡實多糖酶解液為基礎，分別以不同的料液比、超聲時間和超聲溫度為單因素，考察其對芡實多糖提取效果的影響。以單因素試驗結果為依據，以多糖得率（%）為評價指標，進行3因素3水平的正交試驗，確定超聲處理的最優條件。超聲處理正交試驗的因素及水平設計見表2。

2 結果與分析

2.1 酶解條件的確定

2.1.1 纖維素酶用量對多糖得率的影響。

從圖1可以看出，多糖得率隨著纖維素酶用量的增加而增加。當纖維素酶用量達到2.0%時，多糖得率趨于穩定，因此確定纖維素酶用量為2.0%。

2.1.2 果膠酶用量對多糖得率的影響。

從圖2可以看出，隨著果膠酶用量的增加，多糖得率逐漸提高。當果膠酶用量為1.5%時多糖得率增加緩慢并趨于平衡，因此確定纖維素酶用量為1.5%。

2.1.3 酶解時間對多糖得率的影響。從圖3可以看出，芡實多糖得率隨著酶解時間的延長而增加，當超過80 min時開始有所下降，可能是因為隨著酶解處理時間的過度延長，致使多糖結構發生變化。因此，確定80 min作為酶解時間。

2.1.4 酶解溫度對多糖得率的影響。

從圖4可以看出，芡實多糖得率隨著酶解溫度的提高呈先增加后降低的趨勢，當酶解溫度為35 ℃時，多糖得率達到最大，此后出現下降的趨勢。這可能與復合酶的最適作用溫度有關，溫度過高導致酶失活。因此，確定酶解溫度為35 ℃。

2.1.5 酶解處理正交試驗結果。

在單因素試驗的基礎上，選取對超聲波協同果膠復合酶提取芡實多糖影響較大的酶解條件進行正交優化試驗。由表3可知，酶法處理芡實對多糖得率影響因素的主次順序為：酶解溫度>酶解時間>纖維素酶用量>果膠酶用量，最佳水平組合為A1B1C2D2。酶解處理最優條件為：添加纖維素酶1.5%、果膠酶1.0%，酶解時間80 min，酶解溫度35 ℃。

2.2 超聲處理條件的確定

2.2.1 料液比對多糖得率的影響。

從圖5可以看出，隨著料液比的增加，多糖得率逐漸提高，說明料液比的增加，有利于多糖得率的提高。當料液比超過1∶15時，多糖得率趨于穩定，但綜合考慮成本及后續處理工序，進一步試驗選擇用料液比1∶10。

2.2.2 超聲時間對多糖得率的影響。從圖6可以看出，隨著超聲時間的增加，多糖的得率逐漸增加。當浸提時間達到1.5 h時，多糖得率趨于穩定，因此浸提時間以1.5 h左右為宜。

2.2.3 超聲溫度對多糖得率的影響。從圖7可以看出，隨著超聲溫度的升高，多糖得率呈上升趨勢，當超聲溫度在60 ℃以上時多糖得率趨于平穩，多糖得率增加不顯著。但是，當超聲溫度為80 ℃時，由于溫度太高導致芡實里的淀粉糊化，很難分離出清液，吸光度也相應增大很多。綜合考慮，選擇60 ℃作為提取溫度。

2.2.4 超聲處理正交試驗結果。

在單因素試驗的基礎上，選取對超聲波協同果膠復合酶提取芡實多糖影響較大的超聲條件進行正交優化試驗。由表4可知，超聲溫度對超聲提取芡實多糖的提取效果影響最為明顯，其影響順序為超聲溫度>料液比>超聲時間。最優超聲處理條件為A2B2C2，即料液比1∶10、超聲溫度60 ℃、提取時間1.5 h。

3 結論

通過單因素和正交試驗，確定了超聲波復合酶法提取芡實多糖的最佳工藝條件為：添加1.5%纖維素酶、1.0%果膠酶，在35 ℃條件下酶解80 min；以1∶10的料液比在60 ℃下超聲提取1.5 h，此時多糖得率達到12.38%。超聲波的空化效應能增加對原料的破碎效果，增加多糖溶出率，但它對細胞壁的破碎不完全；而復合酶的加入彌補了這一缺陷，使多糖的溶出幾率加大。該工藝簡單可行，對工業化生產芡實多糖具有指導意義。