蟲草發酵菌粉的活性成分分析

許春燕 李恒 陸震鳴

摘要 [目的]比較蟲草頭孢和蝙蝠蛾被孢霉2種發酵菌粉中活性組分的差異，為蟲草發酵菌種的開發提供數據參考。[方法]采用重量法測定多糖含量，采用離子色譜法檢測粗多糖的單糖組成，采用高效液相色譜法測定核苷類物質含量，采用FolinCiocalteu法測定總多酚含量，采用香草醛-高氯酸法測定總三萜含量。[結果]2種菌粉中粗多糖含量在7%左右，均由6種單糖構成；發酵菌粉中均檢測到含量較高的胞苷、鳥苷和腺苷等核苷類化合物；2種蟲草發酵菌粉中總多酚的含量約5 mg/g，三萜物質含量約8 mg/g。[結論]蟲草頭孢和蝙蝠蛾被孢霉2種發酵菌粉在多糖、核苷、多酚和三萜類物質的含量上無顯著差異，均具有較高的藥用活性和良好的開發前景。

關鍵詞 蟲草；蟲草頭孢；蝙蝠蛾被孢霉；發酵菌粉；活性成分

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）34-168-02

冬蟲夏草（Chinese cordyceps）在分類學上屬于子囊菌亞門、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，是一種傳統的中草藥和保健品[1]。蟲草中含有多種活性成分，如蟲草多糖、核苷、甾醇等[2]。現代醫學已經證實了蟲草具有清除自由基[3]、抗腫瘤、增強免疫[4]、降低血糖[5]、抗感染[6]等多種藥理活性。蟲草的多種療效與其內在化學成分的種類與含量是密切相關的[2]。

近年來，蟲草因其特有的生理藥理活性已經引起了廣泛的關注。然而，野生冬蟲夏草資源稀少，僅分布于青藏高原及海拔3 000 m以上、雪線以下的地區。隨人工開發力度的增大，野生冬蟲夏草資源逐漸趨于匱乏，而蟲草的人工栽培較為困難，這些現實問題促使了蟲草發酵技術的產生以及規模化生產的快速發展。目前，蟲草發酵已經實現了工業化生產，能夠滿足人民健康的需求。

蟲草發酵研究的關鍵問題之一是菌種。目前已從野生冬蟲夏草中分離得到了眾多冬蟲夏草菌，其中，用于蟲草發酵研究與開發的菌種主要有中國被毛孢（Hirsutella sinensis X.J.Liu，Y.L.Guo，Y.X.Yu & W.Zeng）、蟲草頭孢（Cephalosporium sinensis Chen）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepialid C.T.Chen & B.Liu）等[7-8]。利用相關菌種已研發出相應的一系列保健品，并形成了一定的產業規模，有關蟲草發酵菌粉的成分研究也已經開展。然而，各種發酵菌粉中的活性成分以及相應的藥理活性尚需要進一步鑒定與比較。筆者在此對蟲草頭孢和蝙蝠蛾被孢霉2種發酵菌粉中的多糖、核苷、多酚及三萜類物質進行了測定，比較這些活性組分在種類及含量上的差異，為蟲草發酵菌種的開發提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲草菌粉。

蟲草頭孢、蝙蝠蛾被孢霉發酵菌粉均由國內某企業提供。

1.1.2 試劑。

齊墩果酸、沒食子酸標準品購于中國食品藥品檢定研究院。其余試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器。

UV2100紫外分光光度計，上海Unico儀器有限公司；氣相色譜儀（GC2010），日本Shinadzu公司；高效液相色譜儀（HPLC），美國Agilent公司；ICS5000離子色譜儀，美國Dionex公司；高速冷凍離心機，Sigma公司；真空干燥儀，美國Savant公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲草多糖含量及單糖組成分析。

采用重量法測定蟲草多糖含量。取蟲草菌粉1 g加入20 ml去離子水，90 ℃水浴0.5 h，冷卻后離心收集上清。重復該過程3次并合并上清。上清液濃縮后，緩慢滴加無水乙醇至乙醇含量達75%，4 ℃過夜后離心，沉淀干燥至恒重后稱重。

準確稱取5 mg多糖加入到2 ml 2 mol/L HCl溶液中，95 ℃水浴5 h后加入等體積的2 mol/L NaOH溶液中和，12 000 r/min離心10 min后取上清進行離子色譜分析。色譜柱為CarboPac PA20；柱溫45 ℃；流動相為水∶NaOH溶液（250 mmol/L）=98.2∶1.8（V/V），流速0.5 ml/min；脈沖安培檢測器。

1.2.2 核苷類物質含量測定。

稱取0.1 g菌粉于EP管中，加入2 ml甲醇-水（1∶1，V/V）溶液，超聲提取 30 min后靜置過夜，12 000 r/min離心后取上清過濾膜供分析。色譜柱為Diamonsil C18（4.6×250 mm）；流動相為甲醇∶去離子水∶磷酸=5∶95∶0.05（V/V/V），流速0.8 ml/min，260 nm紫外檢測；柱溫30 ℃。

1.2.3 總多酚含量測定。

準確稱取菌粉5.0 g于250 ml三角瓶中，加入50 ml 70%乙醇超聲提取30 min，重復操作3次并合并濾液，并定容至100 ml。取待測樣品溶液1.0 ml，再分別依次加1.0 ml FolinCiocalteu試劑及1.0 ml 10% Na2CO3溶液，然后用蒸餾水定容至5.0 ml，在室溫下靜置30 min后用0.5 cm光徑比色杯在波長為765 nm的條件下進行比色測定，以空白試劑為參比[9]。根據沒食子酸標準曲線進行總多酚的定量。沒食子酸標準曲線為y=0.119 1x+0.053 3（R2= 0.997），其中x為沒食子酸濃度（μg/ml），y為吸光值。

1.2.4 總三萜含量測定。

準確稱取菌粉0.5 g于2 ml EP管中，加入500 μl甲醇，50 Hz超聲15 min后過夜，取甲醇提取液100 μl于10 ml具塞試管中，水浴蒸干，加0.3 ml新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 ml高氯酸，60 ℃反應20 min，冰水冷卻，加入10 ml冰醋酸，搖勻后在550 nm 波長下測定吸光度，根據齊墩果酸標準曲線進行總三萜含量測定[10]。齊墩果酸標準曲線為y=0.010 1x-0.009 5，其中x為齊墩果酸濃度（μg/ml），y為吸光值。

2 結果與分析

2.1 蟲草多糖的分析測定

大量醫學試驗證實，多糖是冬蟲夏草中的重要活性成分之一，可活化巨噬細胞刺激抗體產生，提高免疫，抑制炎癥與腫瘤，同時具有修復細胞等功能[11-12]。經檢測，蟲草頭孢和蝙蝠蛾被孢霉2種蟲草發酵菌粉中的粗多糖含量相近，分別為6.24%、7.57%。進一步分析單糖組成發現（表1），2種菌粉的單糖相對含量有所差異，但均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6種單糖構成，其中，半乳糖、葡萄糖和甘露糖為主要組分，約占多糖含量的70%，這與趙秋蓉等[13]研究得出的蟲草多糖的單糖組成一致。

2.2 核苷類物質的分析測定

核苷是蟲草中的有效成分之一，尤以腺苷具有明顯的藥理作用，如改善心腦血液循環、防止心律失常、抑制神經遞質釋放和調節腺苷酸環化酶活性等。我國也已將冬蟲夏草腺苷含量的測定寫入藥典[14]。由表2可知，2種蟲草發酵菌粉中均檢測到了含量較高的胞苷、鳥苷和腺苷，其中，腺苷含量遠高于冬蟲夏草子實體（1.93 mg/g）及固體發酵冬蟲夏草菌絲中的腺苷含量（0.75 mg/g），這與Yang等[15]的研究結果一致。而與其他發酵菌粉相比，蟲草頭孢與蝙蝠蛾被孢霉發酵菌粉中的腺苷含量顯著高于市售蝙蝠蛾擬青霉（金水寶膠囊）、中華束絲孢（百令膠囊）和粉紅膠霉（心肝寶膠囊）發酵菌粉。蟲草頭孢發酵菌粉與市售其他蟲草頭孢菌粉（寧心寶膠囊）相比，則可能由于生產工藝不同，使得不同來源的發酵菌粉中的含量差異較大[16]。蟲草頭孢與蝙蝠蛾被孢霉發酵菌粉的核苷物質含量差異不顯著。肌苷和蟲草素均未檢測到。

表2 蟲草菌粉中核苷類物質含量

mg/g

樣品胞苷鳥苷肌苷腺苷蟲草素

蟲草頭孢9.882.06N.D.5.34N.D.

蝙蝠蛾被孢霉8.721.87N.D.5.90N.D.

注：N.D.表示未檢出。

2.3 總多酚的分析測定

多酚類化合物普遍具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保護心腦血管系統等藥理活性[17]。經測定，2種蟲草發酵菌粉中均含有較高含量的多酚類物質，蟲草頭孢中的總多酚含量（5.11 mg/g）略高于蝙蝠蛾被孢霉（4.52 mg/g）。與其他來源蟲草相比，多酚含量差異較為顯著，這是由于發酵菌種的不同以及發酵條件的差異引起的[18]。

2.4 總三萜的分析測定

三萜類化合物被證明具有抗腫瘤、抑制組織胺釋放、抗HIV、抑制膽固醇生物合成與吸收等多種藥理學活性[19]。經檢測，2種蟲草菌粉均含有較高的三萜含量，蝙蝠蛾被孢霉中的含量（8.29 mg/g）略高于蟲草頭孢中的含量（7.73 mg/g）。

3 結論

該試驗對蟲草頭孢與蝙蝠蛾被孢霉2種蟲草發酵菌粉中的多糖、核苷、多酚及三萜類物質進行了測定，比較這些活性組分在種類及含量上的差異。結果表明，2種菌粉中粗多糖含量在7%左右，均由6種單糖構成；2種蟲草發酵菌粉中均檢測到含量較高的胞苷、鳥苷和腺苷等核苷類化合物，總多酚的含量約5 mg/g，三萜類物質含量約8 mg/g。2種菌粉在這些有效成分的含量上并無顯著差異，表明2種菌粉均具有較高的潛在藥用活性和良好的開發前景。

參考文獻

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