淺析生物芯片化學(xué)發(fā)光免疫法在檢測(cè)人TSH和T4中的價(jià)值

朱海峰

【摘? 要】為了探討生物芯片化學(xué)發(fā)光免疫法在檢測(cè)人TSH和T4中的價(jià)值，本研究建立了生物芯片化學(xué)發(fā)光免疫法，采集15例患者血清，進(jìn)行TSH和T4水平檢測(cè)，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從而得出結(jié)論：采取生物芯片化學(xué)發(fā)光免疫法對(duì)人體血清中TSH和T4水平進(jìn)行檢測(cè)時(shí)具有較高的靈敏度、線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確性高，回收率也高，具有廣泛應(yīng)用的價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】生物芯片化學(xué)發(fā)光免疫法;促甲狀腺激素;甲狀腺激素

Abstract：In order to explore the biological chip chemiluminescence immunoassay in the detection of TSH and T4 value，were established in the study of biological chip chemiluminescence immunoassay，collected 15 cases of serum TSH and T4 levels were detected，and the determination results of statistical analysis，thus draws the conclusion：take on the levels of TSH and T4 in the human body detection serumbiological chip chemiluminescence immunoassay with high sensitivity，good linear relationship，the accuracy is high，the recovery rate is high，has the widespread application value.

Keywords：Biological chip chemiluminescence immunoassay? Thyroid stimulating hormone? Thyroid hormones

為了實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、低成本的檢驗(yàn)?zāi)康模簧傺芯空邍L試在生物芯片上展開(kāi)化學(xué)發(fā)光免疫分析實(shí)驗(yàn)^[1，2]。為了探討生物芯片化學(xué)發(fā)光免疫法在檢測(cè)人TSH和T4中的價(jià)值，本研究建立了生物芯片化學(xué)發(fā)光免疫法，采集15例患者血清，進(jìn)行TSH和T4水平檢測(cè)，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，現(xiàn)將具體情況總結(jié)如下，以供參考。

1儀器和試劑

1.1儀器? 自制圓環(huán)通道生物芯片、BPCL微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x、電子節(jié)能控溫儀、0.5-10ul可調(diào)定量加樣器、85-1磁力攪拌器、HWY-501循環(huán)恒溫水浴、85-2型恒溫磁力攪拌器、真空干燥箱、KQ3200超聲波清洗器。

1.2試劑? TSH標(biāo)準(zhǔn)濃度血清，牛腸堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記的TSH抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記TSH單克隆抗體、偶聯(lián)FITC抗體的磁性分離劑，牛血清白蛋白、氯化鎂為分析純、二乙醇胺為化學(xué)純、磁粉。

1.3配制溶液的方法

DEA洗滌液的配制：取10.51gDEA，將其溶解在800ml的純化水中，而后加入1ml1MMgCl₂溶液和0.2g的氯化鈉，幾個(gè)氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值在9.8-10之間，經(jīng)0.2um的過(guò)濾器對(duì)配制溶液進(jìn)行過(guò)濾，即得DEA洗滌液。

充填緩沖液的配制：0.1molL/Tris-HCl-0.05%，pH7.4。

封閉液的配制：含0.1%小牛血清白蛋白的充填緩沖液。

底物稀釋液的配制：pH值為9.18的Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖溶液。

2方法和結(jié)果

2.1確定TSH檢測(cè)體系實(shí)驗(yàn)條件

2.1.1堿性磷酸酶與底物量的適宜比例

用pH為9.15的Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖溶液將堿性磷酸酶稀釋成不同濃度的溶液，使用底物PPD工作濃度200ul在試管內(nèi)，加入10ul的固定酶，混勻后在BPLC微弱化學(xué)發(fā)光監(jiān)測(cè)以上對(duì)發(fā)光值進(jìn)行觀察，記錄發(fā)光值平衡時(shí)的數(shù)據(jù)^[3]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在[ALP]在.64*10-10M左右或以下時(shí)的[ALP]與化學(xué)發(fā)光值之間存在良好的線性關(guān)系，然而其濃度在1.28X10-12M時(shí)生成產(chǎn)物的平衡時(shí)間發(fā)生了延長(zhǎng)。在堿性磷酸酶濃度在6，4*10-10M與6.4*10-llM范圍之間時(shí)，酶與底物的比例最為適宜。

2.1.2芯片式檢測(cè)法的實(shí)驗(yàn)操作方法

實(shí)驗(yàn)中經(jīng)適合與免疫反應(yīng)的微流控生物芯片，在圓環(huán)型的反應(yīng)池中，線經(jīng)濃度為1%的BSA溶液進(jìn)行封閉，在37℃條件下孵育20分鐘，而后加入2ul抗原、4ul的抗體以及0.5Ul磁粉，在外加旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)的作用下磁粉旋轉(zhuǎn)會(huì)使抗原-抗體的混合加速，在24℃條件下反應(yīng)7分鐘而后加入2ul的磁珠分離液，在外加旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)的左右下常溫混合5分鐘。在外加磁場(chǎng)的作用下，經(jīng)濾紙將反應(yīng)池中的液體吸出，而后經(jīng)DEA洗滌液進(jìn)行反復(fù)洗滌。在反應(yīng)池中加入底物AMPPD溶液后，在外加磁場(chǎng)的作用下常溫反應(yīng)5分鐘，而后經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，記錄數(shù)據(jù)^[4]。

2.1.3測(cè)定靈敏度

計(jì)算靈敏度時(shí)采取最低檢測(cè)限的方法，分別對(duì)濃度為0.075、0.15、0.25和0.5mIU/L的血清平行測(cè)定7次，并使用3倍的標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)確定靈敏度。經(jīng)計(jì)算TSH 0mIU/L的標(biāo)準(zhǔn)差為0.03212，3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為靈敏度，結(jié)果為0.096mIU/L。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

經(jīng)芯片法對(duì)TSH的線性范圍進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)濃度為0、0.15、0.5、1.5、5、5.0mIU/L的標(biāo)準(zhǔn)血清，每個(gè)濃度連續(xù)測(cè)定12次，而后將發(fā)光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，TSH濃度作為橫坐標(biāo)，測(cè)定TSH濃度在0.094-500.094mIU/L之間存在良好的線性關(guān)系，變異系數(shù)在2.4%-10.2%之間。

2.1.5回收實(shí)驗(yàn)

取高中低三個(gè)濃度的血清樣品分別與三種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行4：1混合，對(duì)回收率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TSH回收率在91%-101%之間，平均回收率為98.2%。

2.1.6樣品測(cè)定

以上述建立方法展開(kāi)TSH水平檢測(cè)，具體步驟為：①芯片的前處理。將鍵合好的芯片放置在濃硫酸中，70℃條件下煮1小時(shí)，而后經(jīng)蒸餾水沖洗，在真空干燥箱中進(jìn)行干燥。②經(jīng)濃度為1%的BSA溶液對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行封閉。將BSA溶液充滿(mǎn)整個(gè)反應(yīng)池，并在37℃條件下孵育30分鐘，而后將反應(yīng)池吹干，加入2ul各種濃度標(biāo)準(zhǔn)血清，另加入0.5ul磁粉，之后加入2ul的抗體，在磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌混勻，加入2ul的磁性分離劑，繼續(xù)攪拌。③洗滌。經(jīng)濾紙將反應(yīng)池中的液體吸干，而后經(jīng)DEA洗滌液進(jìn)行洗滌，連續(xù)3次。洗滌結(jié)束后取10ul底物加入到試管中，經(jīng)磁力攪拌器攪拌5分鐘，最后經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行測(cè)定^[5]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本次實(shí)驗(yàn)方法與磁性分離酶聯(lián)免疫法聯(lián)合化學(xué)發(fā)光法的試管檢測(cè)之間存在良好的線性關(guān)系，Y_TSH=1.034X_TSH-0.889，r=0.9892。Y_TSH為磁性分離酶聯(lián)免疫法聯(lián)合化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)TSH，X_TSH為本次實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)TSH。

2.2確定T4檢測(cè)體系實(shí)驗(yàn)條件

2.2.1芯片式檢測(cè)法的實(shí)驗(yàn)操作方法

實(shí)驗(yàn)中經(jīng)適合與免疫反應(yīng)的微流控生物芯片，在圓環(huán)型的反應(yīng)池中，線經(jīng)濃度為1%的BSA溶液進(jìn)行封閉，37℃條件下孵育20分鐘，而后加入1ul抗原、4ulT4衍生物和4ul抗體，最后加入0.5ul的磁粉，在外加磁場(chǎng)的作用下磁粉旋轉(zhuǎn)使抗原-抗體的結(jié)合更加迅速，而后加入2ul的磁珠分離液，常溫下旋轉(zhuǎn)作用5分鐘，經(jīng)濾紙將反應(yīng)池中的液體吸干，經(jīng)DEA洗滌液進(jìn)行反復(fù)沖洗。在反應(yīng)池中加入10ul底物，外加磁場(chǎng)作用下常溫反應(yīng)5分鐘，經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行測(cè)量分析。

2.2.2測(cè)定靈敏度

采取最低檢測(cè)限法對(duì)T4檢測(cè)靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，取低濃度血清連續(xù)進(jìn)樣3次，經(jīng)2倍的標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算靈敏度，結(jié)果得低濃度T4的0ng/ml血清標(biāo)準(zhǔn)差為2.7ng/ml，靈敏度為4.5ng/ml。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在最佳狀態(tài)下，經(jīng)芯片法對(duì)T4線性范圍進(jìn)行測(cè)定，分別取濃度為0、20、40、80、150、300ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)血清，以化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，T4濃度作為橫坐標(biāo)，檢測(cè)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T4濃度在20-150ng/ml之間存在良好的線性關(guān)系，變異系數(shù)為4.85%。

2.2.4回收實(shí)驗(yàn)

取高中低三個(gè)濃度的血清樣品分別與三種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行4：1混合，對(duì)回收率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T4的回收率在92%-103%之間，平均回收率為99.4%。

2.2.5測(cè)定樣品

對(duì)上述統(tǒng)計(jì)的15例患者血清展開(kāi)T4水平測(cè)定，結(jié)果顯示，本次實(shí)驗(yàn)方法與磁性分離酶聯(lián)免疫法聯(lián)合化學(xué)發(fā)光法的試管檢測(cè)之間存在良好的線性關(guān)系，Y_T4=0.99X _T4-2.25，r=0.9981.Y _T4為磁性分離酶聯(lián)免疫法聯(lián)合化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)T4，X _T4為本次實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)T4。

3小結(jié)

在本組研究中，在化學(xué)發(fā)光與免疫檢測(cè)基礎(chǔ)上加用微流控芯片技術(shù)，建立了生物芯片化學(xué)發(fā)光免疫法，成功檢測(cè)了TSH、T4水平。由于在檢測(cè)過(guò)程中，使用了磁粉，使得檢測(cè)的速度有所加快，反應(yīng)時(shí)間有所縮短。此外，該法檢測(cè)時(shí)具有較高的靈敏度，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確性高，回收率也高，具有廣泛應(yīng)用的價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]崔魴，夏云，張莉萍，等.生物芯片法在結(jié)核分支桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值探討[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009，23（19）：1021-1023.

[2]馬連學(xué).游離前列腺特異抗原免疫放射分析方法的建立[J].同位素，2009，23（01）：445-446.

[3]王穎.生物芯片技術(shù)及其應(yīng)用研究[J].科學(xué)教育，2010，17（01）：221-223.

[4]惠國(guó)華，趙子愷.液相芯片技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2010，17（06）：982-983.

[5]顏多清.化學(xué)發(fā)光與酶聯(lián)免疫檢測(cè)血清甲胎蛋白的比較[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師（醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)半月刊），2009，24（17）：187-188.