銀杏葉提取物對缺血再灌注肺損傷中血紅素氧合酶影響的研究

余韶衛等

摘要：目的：研究分析銀杏葉提取物對缺血再灌注肺損傷內血紅素氧合酶的影響。方法：選擇實驗動物中心提供的60只健康小鼠，隨機性平均分成四組，分別為對照組、I/R組、GBE組、ZnPP-IX組。結果：各組間H0-1活性相比，P<0.05有統計學意義。GBE組MDA水平明顯低于I/R組、ZnPP-IX組，差異P<0.05有統計學意義。結論：銀杏葉提取物能夠誘導血紅素氧合酶的表達，對I/R肺損傷具有良好的保護作用。

關鍵詞：銀杏葉提取物；缺血再灌注肺損傷；血紅素氧合酶；影響

肺移植后一般會出現缺血再灌注（即為I/R）損傷，以至于肺損傷造成移植后早期肺功能障礙、受體死亡。研究發現[1]，血紅素氧合酶1（簡稱HO-1）的高水平濃度是細胞拮抗氧化應激損傷的一項關鍵的內源性保護因子。銀杏葉提取物（簡稱GBE）能夠對細胞中的HO-1的表達進行誘導，促進HO-1的合成及分泌。現針對肺 II 型細胞 I/R損傷試驗小鼠進行深入研究，觀察GBE對細胞內HO-1的表達是否有所影響及對I/R肺損傷是否存在保護作用，研究如下。

1材料與方法

1.1材料

銀杏特提取物（悅康藥業集團有限公司，規格為5.0 ml：17.5 mg）。羅氏公司提供的COBAS 全自動生化分析儀，型號為INT EGRA400。H0-1免疫組化SABC試劑盒，由武漢博士德公司提供。其他試劑主要是分析純。選擇實驗動物中心提供的60只小鼠，體重為18-23 g，平均（20.54±1.48）g。

1.2方法

1.2.1 A549細胞培養

A549細胞即為肺 II 型細胞株，對A549細胞進行復蘇，然后在DMEM 培養基上完成接種，其中含有100 lug/ml的鏈霉素、100 U/ml的青霉素、10%濃度的胎牛血清。放置在37攝氏度、二氧化碳體積分數為5.0%、飽和濕度環境下進行培養，等到細胞貼壁后在第二天更換液體。當細胞鋪滿瓶底后[2]，應用PBS 進行沖洗，用0.25%濃度的胰蛋白酶進行消化，離心時收集細胞以便傳代。

1.2.2制備肺 II 型細胞 I/R 模型

將A549細胞加入到甲右旋糖酐溶液（簡稱LPDG）內，放置在40 C、100% O2的封閉箱內培養12小時，模擬肺缺血。再更換成含有10%濃度的胎牛血清的DMEM，放置在37攝氏度、二氧化碳濃度為5.0%的培養箱內培養2小時，然后模擬再灌注[3]。

1.3實驗分組

I/R組：A549細胞模擬缺血16小時，再灌注2小時。GBE組：應用GBE預處理24小時候，缺血12小時，再灌注2小時。ZnPP-IX組：應用GBE、Znpp-IX預處理24小時，缺血12小時，再灌注2小時。對照組：A549細胞進行常規培養。

1.4細胞損傷指標檢查

1.4.1檢查細胞存活率

在培養瓶中應用胰蛋白酶對肺 II 型細胞進行消化，溶入0.5%濃度的臺盼蘭，3分鐘后，認真計算藍染、沒有藍染的細胞計數，得出細胞存活率。

1.4.2檢查線粒體呼吸能力（英簡MR）

檢查前，先把每組培養液更換成含有5.0%濃度的胎牛血清DMEM，再加入 hanK 液對四氮甲基唑藍（簡稱MTT）進行溶解，最終濃度為0.5 mg/ml，放在37攝氏度環境中孵育1小時。認真吸棄培養液，滴入100 ul的二甲基亞砜（簡稱DMSO），輕慢搖動混勻培養液，應用450 nm的波長檢查其吸光度。對照組吸光度100%作為標準，計算其余三組吸光度的百分比情況，以此表示細胞線粒體呼吸的能力。

1.4.3細胞上清液 MDA水平

在低溫狀態下離心培養液，每分鐘1000 r，離心5分鐘，吸取上清液，MDA 水平應用硫代巴比妥酸比色法進行檢測[4]。

1.4.4凋亡的檢查

收集2.0×106個肺 II 型細胞，進行離心沉淀，應用3.0%濃度的戊二醛進行固定，然后通過電鏡檢測。同時，收集1.0×106個細胞，應用PBS沖洗兩次，通過碘化丙啶（簡稱P1）與FITC-Annexin V雙染色后，使用流式細胞術凋亡率。

1.4.5 H0-1活性檢查

細胞經5體積冷 TRis/Hcl 緩沖液進行離心，離心處理2次，分別是3.5 kg，20分鐘；0.8 kg，10分鐘，使線粒體沉淀。對上清液進行再次離心（105kg，90分鐘），致使微粒體分離。應用100 mmol/L濃度、PH值7.4 的焦磷酸鈉將血紅蛋白除去，將磷酸鉀緩沖液制備成微粒體懸液。

1.5統計學分析

通過SPSS 17.0 統計學軟件對數據進行對比分析，對于計量資料，應用方差±表示，并使用配對樣本t進行檢驗；對于計數資料，則用百分比（%）表示，然后利用X2進行檢驗。當P值小于0.5時，說明試驗結果有統計學意義。

2結果

各組間H0-1活性相比，P<0.05有統計學意義。GBE組MDA水平明顯低于I/R組、ZnPP-IX組，差異P<0.05有統計學意義。詳見表1.

3討論

肺部因為存在獨特性易損的組織結構，對缺血引起的損害具有較高的敏感性，肺移植后一般會出現缺血再灌注（即為I/R）損傷，造成移植后早期肺功能障礙、受體死亡[6]。本次試驗通過模擬肺 II 型細胞I/R 損傷，在細胞、分子水平方面論證銀杏葉提取物（即為GBE）具有較強的抗 I/R 肺損傷功能，進一步了解銀杏葉提取物的作用途徑及對血紅素氧合酶含量的影響，進而為尋找新的抗肺移植 I/R 損傷及肺保護藥物提供科學的實驗依據。

以往關于銀杏葉提取物的大量文獻表明，銀杏葉提取物存在松弛支氣管、消解平滑肌痙攣、促進循環、拮抗血小板活化因子（英簡PAF）、清除氧自由基等作用[7]。銀杏葉提取物是治療腦、腎、肺 I/R 損傷的一種天然中藥[8]，具有極大的研發潛質。銀杏葉提取物的主要作用機制在于充分發揮抗氧化應激、清除氧自由基的作用，并且已經有研究證實銀杏葉提取物能夠降低心腦器官的I/R 損傷。本次研究通過對健康小鼠模擬肺 I/R 損傷與常規培養、GBE預處理、GBE、Znpp-IX預處理三組小鼠進行對比試驗，提示增強HO-1的活性，對肺 I/R 損傷起到了良好的保護作用，可延長肺 I/R 小鼠的存活率。銀杏葉提取物可以有效誘導血紅素氧合酶的表達，并且血紅素氧合酶是已知存活在細胞微粒體內的一種關鍵性能夠被誘導的抗氧化酶，同時也是細胞拮抗氧化應激性損傷的一種標志性內源保護因子。通過上述試驗及結論可以推斷，銀杏葉提取物能夠誘導血紅素氧合酶的表達，對 I/R 肺損傷具有良好的保護作用。

參考文獻：

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