分子標記技術改良水稻白葉枯病抗性研究進展

劉峰等

摘要在前人的水稻白葉枯病分子育種研究基礎上，綜述了白葉枯病抗性基因的發掘和分子標記輔助選擇改良水稻白葉枯病抗性的應用，并做了小結和展望。

關鍵詞分子標記；分子標記輔助選擇；白葉枯病；水稻

中圖分類號S188文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）21-036-02

水稻作為我國的主要糧食作物容易受到病害侵襲，造成產量和品質的下降，對我國糧食安全造成負面影響。水稻白葉枯病（Xanthomonas oryzae pv. oryzae， Xoo）作為水稻三大病害之一，容易受到環境誘發，這一特性使得水稻生產者難以對其發病做出快速有效的預防和控制措施，從而造成不可估量的稻米減產。目前，最有效的對策是利用水稻自身的白葉枯病抗性來對病害進行預防和控制[1]。一些水稻品種，尤其是地方品種，在同當地特有的白葉枯病病原菌進行生存競爭和協同進化的過程中逐漸形成對白葉枯病病菌具有抵抗作用的抗性基因。這些來自水稻基因組的抗病基因被分子育種者用來對非抗病的優良品系（品種）進行抗病性改良。通過分子標記輔助選擇的育種手段將一個或者多個抗白葉枯病基因導入到待改良的品系（品種）中，大大增加了抗病育種的目的性和可行性。筆者結合近年來前人對白葉枯病分子育種的研究，對水稻白葉枯病抗性基因的發掘、分子標記輔助選擇改良水稻白葉枯病抗性和分子標記抗性改良過程中存在的問題進行了歸納和論述，旨在為深入研究分子標記輔助選擇改良水稻白葉枯病抗性提供理論依據和經驗參考。

1水稻白葉枯病抗性基因發掘

水稻白葉枯病于1884年在日本福岡地區首次被發現，隨后世界多地報道發現該病。1950年，我國南京郊區首次發現該病[2]。該病屬于檢疫性病害，病菌隨種子迅速擴散到其他地區，導致我國白葉枯病病區不斷擴大。20世紀80年代，國際水稻研究所（IRRI）和日本熱帶農業研究中心（TARC）合作建立了統一的國際水稻白葉枯病抗性鑒別系統，該系統的建立掀開了白葉枯病抗性基因發掘的新篇章。

據國家水稻數據中心統計，截至2013年3月，經國際注冊確認和期刊報道的水稻白葉枯病抗性基因共38個。其中，26個為顯性基因Xa，12個為隱性基因xa；已被定位的抗性基因有26個，并且，Xa1、 xa5、 xa13、 Xa21、 Xa23、 Xa26、 Xa27等7 個基因已成功克隆。

白葉枯病抗性基因來源除了廣泛的栽培稻資源之外，還包括野生稻和誘變體/突變體資源。研究者在野生稻中總共發現了7個抗病基因，分別是Xa21（長藥野生稻）[3]、Xa23（普通野生稻）[4]、Xa27（小粒野生稻）[5]、Xa29（t）（藥用野生稻）[6]、Xa30（t）（普通野生稻）[7]、Xa32（t）（澳洲野生稻）[8]、xa32（t）（疣粒野生稻）[9]。在水稻誘變體/突變體中發掘的抗病基因為xa15、xa19、xa20和Xa25（t）[10]。對這些來自野生稻的抗病基因的發掘非常重要，尤其是具有廣譜持久抗性基因，如Xa21和Xa23。利用雜交連續回交自交并結合分子標記輔助選擇的方法，將這些抗病基因導入到栽培稻的基因組中形成株系，從而有利于解決野生稻的雜交后代不利連鎖不能應用于育種的困難。

廣譜持久抗病性基因始終是水稻育種家們追逐的目標。Xa7源于孟加拉國水稻品種DV85，表現成株期抗性，并且抗性持久、抗譜廣[11]。劉曉輝的研究表明，Xa7對來自我國和日本的45個不同菌株具有高抗效果[12]。除此之外，還有研究表明該基因對我國的另外7個白葉枯病生理小種表現抗性[13]。Xa21源自西非長藥野生稻，表現完全顯性、成株抗性。Ronald等將Xa21定位于第11號染色體上，隨后Song等將該基因克隆出來[14-15]。劉曉輝的研究揭示Xa21對來自菲律賓、日本和我國的72個不同類型的白葉枯病菌株具有高抗性，該基因的抗譜廣于Xa7[12]，因此，該抗病基因被世界抗病育種者廣泛應用。Xa23源自我國普通野生稻（Oryza rufipogon），由章琦等鑒定[16]，隨后由王春連將該基因定位于分子標記C189和CP02662之間[17]，2006年被成功克隆。該基因對現有國內外白葉枯病鑒別菌系（如菲律賓小種1～10、中國致病型小種1～7和日本小種1～3）都表現高抗，且完全顯性、全生育期抗病。Xa23這些特性使得它成為繼Xa21之后又一個備受水稻抗病育種者歡迎的抗白葉枯病基因。

2分子標記技術在水稻白葉枯病改良中的應用

2.1常用于水稻育種的分子標記技術

自分子標記創立至今，出現了多種分子標記類型。這些分子標記類型可以概括為四大類別：①基于DNA分子雜交技術的分子標記，如限制性片段長度多態性（Restriction fragment length polymorphism， RFLP）；②基于PCR技術的分子標記，如隨機擴增多態性DNA （Random amplified polymorphic DNA， RAPD）；③基于限制性內切酶和PCR技術的分子標記，如擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism， AFLP）；④基于芯片技術的分子標記，如單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）。其中，基于PCR技術的分子標記以其操作簡便、檢測靈敏、成本低廉等特點受到分子育種者的青睞，是常用的分子育種手段。該類分子標記除了RAPD外，還有簡單重復序列（SSR）、簡單序列重復區間（ISSR）、序列標簽位點（STS）、相關序列擴增多態性（SRAP）、序列特異性擴增區（SCAR）等。SSR、SRAP和SCAR標記都具有共顯性的特點，在分子檢測的過程中可以分辨雜合體和純合體，這對于分子育種具有特殊意義。

2.2常用的水稻白葉枯病分子標記

利用分子標記輔助選擇改良水稻白葉枯病抗性的關鍵環節之一就是找到與抗病基因緊密相連或者共分離的分子標記。表1列出了20個白葉枯病抗性基因的連鎖分子標記可供參考（部分數據來自國家水稻數據中心）。

2.3水稻抗病葉枯病分子育種進展

作為第一個被克隆的具有廣譜抗性抗白葉枯病基因Xa21，被廣泛應用于水稻MAS（分子標記輔助選擇）抗病改良中。彭應財等利用MAS把白葉枯病抗性基因Xa21導入到強優恢復系輻恢838中，選育出抗白葉枯病恢復系中恢218，用其配成的組合于2002年2月通過江西省品種審定[18]。曹立勇等利用MAS育成帶有抗白葉枯病基因Xa21的恢復系中恢8006，再與印水型胞質不育系中9A組配育成中晚兼用雜交稻國稻1號[19]。

李進波等以攜帶抗白葉枯病基因Xa23的抗病品系CBB23為抗源，以優良雜交稻親本9311和1826為受體材料，采用雜交和復交，在分離群體中利用與Xa23緊密連鎖的EST標記C189進行分子標記輔助選擇，通過苗期分子標記檢測和成株期農藝性狀選擇，獲得160份目標基因純合且農藝性狀穩定的株系[20]。閆成業等將廣譜抗性基因Xa23滲入到恢復系R1005中，綜合農藝性狀選擇和Xa23基因分子標記選擇，獲得1份具有Xa23基因的優良株系CY117014[21]。劉毅等以攜帶抗白葉枯病基因Xa23的水稻材料“CBB23”為供體材料，以保持系“滬旱1B”為受體材料，采用雜交和回交結合MAS的方式，在BC3F5后代株系中獲得Xa23基因純合且表型與“滬旱1B”相似的株系10份，并且明顯提高了對白葉枯病的抗性[22]。

近年來，單個抗性基因的導入方式已經不能滿足水稻品種的廣譜長效抗病性的要求，越來越多的育種者開始利用MAS將多個抗病基因通過聚合育種的方式累積到一個水稻品種（系）或株系中。肖武名等通過MAS將水稻種質H4的主效稻瘟病抗性基因Pi46（t）與CBB23的廣譜白葉枯病抗性基因Xa23聚合，獲得的8個株系對測試的稻瘟病菌株均具有較廣的抗譜、遠高于CBB23的抗譜；對白葉枯病達到抗或高抗水平、遠優于H4的抗性水平[23]。朱玉君等利用MAS將恢復基因Rf3和Rf4、抗稻瘟病基因Pi25和抗白葉枯病基因Xa4、Xa21和Xa5聚合到同一水稻株系，實現該恢復系株系兼抗稻瘟病和白葉枯病[24]。閆成業等以先恢207為受體親本，華恢20（攜帶Xa7和Xa21基因）和CBB23（攜帶Xa23基因）為供體親本，通過雜交、回交、分子標記輔助選擇和基因聚合育種，育成了攜帶Xa7、Xa21、Xa23、Xa7+Xa21、Xa7+Xa23基因的株系[25]。潘曉飚等利用分子標記輔助選擇和田間鑒定選擇相結合的方法，將三黃占2號的抗稻瘟病主基因PiGD1（t）、PiGD2（t）和主效QTL，GLP86（t）及抗白葉枯病基因Xa23導入到明恢86、蜀恢527和浙恢7954等3個骨干中秈恢復系，通過復交進行基因聚合，獲得雙抗株系[26]。

3小結與展望

綜上所述，明確了截止到2013年，已經被發現的白葉枯病抗性基因有38個，成功克隆了7個；經過多年的發展，育種者利用MAS成功將多個抗白葉枯病基因導入水稻品種中，提高了抗病性。

然而，分子標記技術應用于水稻白葉枯病抗性改良時存在不足。抗病基因的共顯性分子標記有待進一步開發，一些非共顯性分子標記的應用使得不能分辨抗病基因的雜合和純合狀態。基于已經成功克隆的抗病基因設計功能基因分子標記缺乏，利用功能基因分子標記輔助選擇抗病水稻品種可以更好地解決假陽性后代和抗病基因不表達等問題。育種者對于手中的水稻材料攜帶什么抗病基因了解不夠，因此，有必要對水稻資源進行分子標記分析。筆者對收集到的部分水稻資源進行了抗病分子標記分析，初步結果顯示，近年來廣東水稻資源間攜帶抗白葉枯病基因種類和分布廣度相差大，可以通過分子標記技術導入抗性基因進行改進。

病菌與抗病基因是一對協同進化的矛盾統一體。白葉枯病菌及其抗性基因在長期的競爭中不斷進化，然而，病菌的變異速度要快于抗性基因的適應速度，而且，由于人們長期大面積推廣單一抗病基因水稻品種更是加劇了這一差異。近年來，我國一些稻區出現白葉枯病暴發現象就說明了這一點。為了控制病菌，應該合理應用抗病基因。通過菌群結構變化測報，制定投放相應的抗病基因。對投放的抗病基因進行合理輪換，加大多個抗病基因聚合力度，并且發掘新的抗白葉枯病基因。

參考文獻

[1]

章琦.水稻白葉枯病抗性基因鑒定進展及其利用[J].中國水稻科學，2005，19（5）：453-459.

[2] 沈光斌.水稻白葉枯病菌對噻枯唑抗藥性監測及治理基礎研究[D].南京：南京農業大學，2001.

[3] SONG W Y， WANG G L， CHEN L L， et al.A receptor kinaselike protein encoded by the rice disease resistance gene， Xa21[J].Science， 1995， 270（5243）：1804-1806.

[4] 章琦.普通野生稻抗白葉枯病新基因被正式命名為Xa23[J].作物雜志，2003（1）：20.

[5] AMANTEBORDEOS A，SITCH L A，NELSON R， et al.Transfer of bacterial blight and blast resistance from the tetraploid wild rice Oryza minuta to cultivated rice，Oryza sativa[J].Theor Appl Genet， 1992， 84（3）：345-354.

[6] 譚光軒， 任翔， 翁清妹， 等.藥用野生稻轉育后代一個抗白葉枯病新基因的定位[J].遺傳學報，2004，31（7）：724-729.