無患子總皂苷體外抑制酪氨酸酶活性的研究

陳雷等

摘要

[目的]研究無患子總皂苷體外對酪氨酸酶的抑制率。[方法]超聲波提取法，溶劑用水、30%乙醇和60%乙醇對無患子總皂苷提取，用大孔樹脂（D101）富集水、30%乙醇和70%乙醇部分，紫外分光光度計法，測量酪氨酸酶抑制率。[結果]超聲波提取得率中，水提得率（18.56%）最高，60%乙醇提取得率為14.46%，而30%乙醇提取得率為17.85%，接近水提取得率；大孔樹脂富集后70%乙醇洗脫部分抑制率高于30%乙醇部分和水部分；與熊果酸比較，70%乙醇洗脫部分、30%乙醇洗脫部分和總皂苷對酪氨酸酶均具有明顯的抑制作用。[結論]無患子總皂苷及30%乙醇和70%乙醇大孔樹脂洗脫部位對酪氨酸酶抑制率較高，可以作為優良的美白護膚品天然添加劑，應用于生產中。

關鍵詞 無患子；總皂苷；酪氨酸酶；體外；抑制率

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）21-056-03

基金項目 吉林農業科技學院大學生科技創新科研項目（2014052）。

作者簡介

陳雷（1989-），男，吉林松原人，本科生，專業：中藥資源與開發。*通訊作者，講師，碩士，從事中藥新藥開發研究。

收稿日期20150526

無患子（Sapindus mukurossi Gaertn.）本草綱目中稱為木患子，我國產于長江流域以南。無患子具有很強藥用價值，其果皮、種子、種仁、根、皮、葉均可以用作醫藥原材料[1]， 現代藥理學研究證明無患子還具有抗菌作用、抗腫瘤、降壓和心臟保護作用、保肝作用、免疫調節、抗病毒、鎮痛等多種藥理作用[2]。無患子總皂苷洗滌液對于汞、錳、福、砷、鉛等重金屬的洗滌效果明顯[3]。無患子總皂苷還是很好的農藥乳化劑，對蝸牛、蒼蠅、蚊子、棉蚜蟲、紅蜘蛛等均有較好的殺滅效果[4]。無患子果皮皂苷含量豐富，含量約為5.33%[5]，主要為三萜皂苷類、倍半萜糖苷類，具有較強的表面活性作用[6-7]。明代李時珍在本草綱目中記載：無患子洗頭去風明目，洗面增白祛斑。筆者在此主要研究無患子抑制酪氨酸酶[8-9]的作用，篩選美白護膚化妝品天然添加劑。

1材料與方法

1.1試驗儀器

JYT2型藥物天平（上海醫用激光儀器廠）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；WMZK72型指針式電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械廠）；DHG9035A型電熱鼓風干燥箱（上海源長實驗儀器設備廠）；SY360型超聲提取器（上海寧商超生儀器有限公司）；紫外可見分光光度計UV1700PharmaSpec（北京普析通儀器有限公司）。

1.2 試驗材料

無患子果皮（2012年9月購于海寧市鹽官苗木合作社，產于浙江）；D101型大孔樹脂（天津農藥廠）；L酪氨酸（日本味之素公司）；酪氨酸酶（25 000單位/mg，sigma公司）；DOPA（購自sigma公司，用PBS緩沖液配制成所需濃度單位）；磷酸緩沖鹽（北京化工有限公司）；95%乙醇。

1.3試驗方法

1.3.1

無患子總皂苷的提取。

用藥物天平稱取約為10 g的干燥無患子果皮3份，提取以料液比1∶5分別加入蒸餾水、30%乙醇、60%乙醇各50 ml，提取溫度為35 ℃，超聲功率為360 W，超聲提取時間為30 min/次[10-13]，共3次，合并各組份提取物，烘干稱重。

1.3.2

無患子總皂苷大孔樹脂吸附富集[14-15]。

1.3.2.1

大孔樹脂預處理。取D101樹脂用95%乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，用95%乙醇洗至流出液加5倍量無白色渾濁為止。用純水洗至中性，備用。

1.3.2.2

大孔樹脂吸附富集。

合并無患子總皂苷粗提物，將其按5 g/份取3份，分別放入標號為A、B、C的50 ml燒杯中。加10倍量的水溶解，靜置沉淀后過濾，定容至50 ml容量瓶中。準確量取已經預處理的濕樹脂200 ml 3份，濕法上3個大孔樹脂柱（標號A、B、C），分別上樣5 g提取物，依次以蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇各3倍體積量依次洗脫。收集A、B、C 3個大孔樹脂柱的水、30%乙醇和70%乙醇各個的洗脫部位置于電熱鼓風干燥箱中40 ℃烘干，記錄數據，計算平均值得率，合并備用。

1.3.3

酪氨酸酶活性抑制率試驗。

酪氨酸酶抑制率按文獻[16-17]方法，于475 nm處測吸光度，得出抑制率作比較。按表1準確吸取A、B、C、D 4組反應液，每組設平行3組試管，25 ℃溫育5 min立即轉移比色皿中于475 nm吸光值。B組空白組，記錄A、C、D吸光度值。依據公式計算酪氨酸酶的抑制百分率，即酪氨酸酶的抑制百分率=（A-B）-（C-D）A-B×100%。

2 結果與分析

2.1 無患子總皂苷提取

從表2可以看出，在超聲波提取無患子總皂苷提取液過程中，水提得率最高（18.56%），60%乙醇得率最低（14.46%），而30%乙醇提取含量接近水提取得率，為17.85%；色澤上，60%乙醇提取物色澤較深，為棕色，30%乙醇提取物顏色為黃色，而水提取物顏色最淺，為淺黃色。

2.2無患子提取物大孔樹脂不同洗脫部位得率

對于大孔樹脂富集情況（表3）來看，水洗脫部分占總提取物28.47%，其中主要部分為水溶性物質，不是主要皂苷類成分，30%乙醇提取部分含有約19.84%，屬于含糖量大的皂苷類物質，而70%乙醇洗脫部分得率為34.00%，為主要三萜皂苷類，根據文獻報道[14]，該部分為主要皂苷類活性成分。

2.3無患子皂苷酪氨酸酶活性抑制結果

通過測試各個不同洗脫部位所配置濃度（0.2 、0.5、1.0 mg/ml）供試品溶液吸光度值，然后計算其各組分對酪氨酸酶抑制率。

從圖1可以看出，無患子提取物對酪氨酸酶有很強的抑制作用，其中總提取物、30%乙醇和70%乙醇洗脫組分在1.0 mg/ml濃度上抑制率很強，與熊果酸抑制率相似，而大孔樹脂水洗脫組分抑制率較低。

不同濃度提取物對酪氨酸酶抑制作用顯著不同，在0.2～1.0 mg/ml范圍內隨提取物濃度增加抑制率升高，提取物對酪氨酸酶活性抑制效率最高的質量濃度為1.0 mg/ml。70%乙醇大孔樹脂洗脫組分抑制率高于30%乙醇組分，表明該部分為主要酪氨酸酶抑制成分，水洗部分抑制率低，該部分成分抑制酪氨酸酶活性不強。

3討論

通過對水和不同濃度乙醇溶液提取比較，水提得率較高，60%乙醇含量較少，主要原因是無患子果皮中含有較多糖類物質，隨著乙醇濃度提高，糖類物質浸出較少，反而以沉淀形式析出。在試驗過程中可觀察到醇的濃度越高，無患子粗提物的色澤更深，可能皂苷含量更多，或在提取中有部分色素易溶于有機溶劑的緣故。而在后續步驟采取洗脫后的無患子總皂苷進行抑制酪氨酸酶活性試驗，超聲提取法由于提取溫度低、提取時間短，更有利于保留無患子皂苷的生理活性。

在皮膚黑色素生成系列反應中，酪氨酸酶在生物體內具有重要的生理功能，它與人體由于色素沉積而引起的雀斑、褐斑等有關。在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸生成還原型多巴，進而氧化成醌式結構，經過系列代謝反應，多巴醌形成多巴色素和5，6二羥基吲哚，然后轉化為黑色素[16-17]。因此，抑制酪氨酸酶活性可以起到阻斷人體皮膚黑色素形成機制，進而起到皮膚美白的效果。

無患子在民間常用于美白祛斑藥物，在抑制酪氨酸-多巴試驗中，無患子水提取物經過大孔樹脂吸附處理，得到30%乙醇和70%乙醇組分其抑制酪氨酸酶較強，分別為82.29%和84.21%，同時總提取物抑制率也較高（80.23%），以上3種組分具有較強的抑制效果，均與熊果酸抑制率接近，且成分的穩定性好，可以用于美白護膚產品天然提取物添加劑，其主要原因可能是無患子中含有三萜皂苷類、倍半萜糖苷類，對酪氨酸酶有較強的抑制作用，同時也表明該成分是無患子主要成分[14]。無患子作為天然產物，符合當前人們消費理念，歐洲現在開發許多植物提取物作為化妝品添加成分，受到消費者的大力追捧，無患子也將成為不久的將來化妝品中最具有潛力的美白護膚添加劑。

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