降解牛糞纖維素的復(fù)合微生物菌劑制備

梁文涓等

摘要

[目的]制備降解牛糞纖維素的復(fù)合微生物菌劑。[方法]通過正交試驗(yàn)，確定地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和放線菌屬4株菌的最優(yōu)配比，制成降解牛糞纖維素的復(fù)合微生物菌劑。[結(jié)果]復(fù)合微生物菌劑中HP2菌的所占比例為主要因素，各菌種最佳配合比例為TG1

∶P3∶HP2∶HN1=3∶1∶1∶1。[結(jié)論]該研究為復(fù)合微生物菌劑在牛糞堆肥中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 復(fù)合微生物菌劑；牛糞纖維素；生長曲線；正交試驗(yàn)

中圖分類號S811.6；Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）21-243-02

我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，畜禽糞便對環(huán)境的威脅成為一個(gè)不可忽視的問題。在減輕污染程度的基礎(chǔ)上最大程度地實(shí)現(xiàn)固體廢棄物資源化利用方式中，畜禽糞便的堆肥化處置是最佳的方式[1]。牛糞屬于冷性堆肥材料，其中纖維素占了很大的比例，因而牛糞較其他畜禽糞便難于分解。將微生物菌劑應(yīng)用于牛糞堆肥，可以加速牛糞中纖維素的降解，縮短起溫時(shí)間，加快牛糞腐熟，提升堆肥質(zhì)量。筆者研究了降解牛糞纖維素的復(fù)合微生物菌劑的制備，以期為進(jìn)一步研究復(fù)合微生物菌劑在牛糞堆肥中的應(yīng)用效果提供基礎(chǔ)材料和數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1.1

菌種。前期研究中從腐熟牛糞與土壤中分離出HN1（枯草芽孢桿菌）、HP2（地衣芽孢桿菌）、TG1（放線菌）、P3（枯草芽孢桿菌）4株菌，用于復(fù)合菌劑制備。

1.1.2

儀器。主要儀器包括DPX650型恒溫培養(yǎng)箱、YJ875型超凈工作臺、BHG1型電熱恒溫干燥箱、HZQQ型搖床、628B型高壓蒸汽滅菌鍋、OLYPUS型顯微鏡、DT52型離心機(jī)、UV1100型紫外可見分光光度計(jì)。

1.1.3

培養(yǎng)基。羧甲基纖維素鈉液體發(fā)酵培養(yǎng)基：CMCNa 0.5%，蛋白胨0.3%，（NH4）2SO4 0.2%，KH2PO4 0.4%，CaCl2 003%，MgSO4·7H2O 0.03%，Tween80 0.02%。豆餅粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖0.7%，豆餅粉0.4%，KH2PO4 0.03%，MgSO4 005%，F(xiàn)eCl3 0.03%，CaCO3 0.4%，酵母膏0.1%，pH=7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1

菌種活化。將P3、HP2、HN1接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基，TG1接種到高氏液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化。活化條件：30 ℃下轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h。

1.2.2

細(xì)菌和放線菌生長曲線測定。將活化的P3、HP2、HN1菌株接種到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中，每隔1 h取發(fā)酵液1 ml稀釋，使OD值為0.1～0.6。每個(gè)發(fā)酵液樣品按相同倍數(shù)稀釋，分別測其OD值，直到20 h后細(xì)菌生長穩(wěn)定期開始。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制各菌株的生長曲線。

將活化的TG1菌株接種到豆餅粉液體培養(yǎng)基中，抽濾后稱干重，測定放線菌的生長曲線，每12 h測一次菌體干重。稱量時(shí)先將濾紙烘干再稱重，菌體放在已稱重的濾紙上抽濾，再將菌體與濾紙一起烘干后稱重，菌體干重即為兩次稱量的差值[2]。采用與P3相同的方法，繪制TG1菌株的生長曲線。根據(jù)菌種的生長曲線，確定最佳轉(zhuǎn)移接種時(shí)間。

1.2.3

復(fù)合微生物菌劑配比的確定。因牛糞粗纖維素含量高達(dá)32.5%，主要參考指標(biāo)為纖維素酶活，將發(fā)酵好的菌液組合進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1），確定各菌種之間的配合比例。測定相應(yīng)的纖維素酶活，選擇最大纖維素酶活的菌種配比作為復(fù)合菌劑的最佳比例。

1.2.4

混合發(fā)酵液纖維素酶活的測定。將菌株分別接種于羧甲基纖維素鈉液體發(fā)酵培養(yǎng)基與豆餅粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)64 h后測定纖維素酶活。羧甲基纖維素（CMCase）酶活性測定依據(jù) 《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 202872006）[3]；濾紙（FPA）酶活性測定依據(jù)《微生物肥料生產(chǎn)菌株質(zhì)量評價(jià)通用技術(shù)要求》（NY/T 18472010）[4]。

1.2.5

固體復(fù)合微生物菌劑的制備。將發(fā)酵好的菌液吸附于滅菌的稻殼粉中，每千克稻殼粉吸附600 ml發(fā)酵菌液，拌勻后風(fēng)干。按照最佳配比混合拌勻后，測定混合發(fā)酵液纖維素酶活。

1.2.6

復(fù)合微生物菌劑的菌數(shù)測定。堆肥用的微生物菌劑應(yīng)符合《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 202872006）的要求，對自制復(fù)合微生物菌劑采用平板計(jì)數(shù)法測定菌數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1 菌株最佳接種時(shí)間的確定

由圖1可知，P3在5 h之前生長滯后，菌體生長量不大；5 h之后進(jìn)入了對數(shù)生長期，菌體開始大量繁殖；8 h之后進(jìn)入了穩(wěn)定期，菌體不再大量生長，與環(huán)境形成了相對穩(wěn)定的狀態(tài)。8 h為P3對數(shù)生長期的末期，單個(gè)菌體的活性較強(qiáng)，且菌數(shù)也較高，所以第8小時(shí)為

P3的最佳轉(zhuǎn)移接種時(shí)間。同理，第9小時(shí)為HP2的最佳轉(zhuǎn)移接種時(shí)間，第8小時(shí)為HN1的最佳轉(zhuǎn)移接種時(shí)間，第96小時(shí)為P3的最佳轉(zhuǎn)移接種時(shí)間。

2.2 復(fù)合微生物菌劑配比的確定

由表2可知，TG1∶P3∶HP2∶HN1=3∶1∶1∶1時(shí)，纖維素酶活最大。各個(gè)因素的極差為：RA=0.664，RB=0.783，RC=1.130，RD=0.994，因此HP2所占比例為主要因素。由于正交試驗(yàn)當(dāng)中沒有此比例，所以單做TG1∶P3∶HP2∶HN1=3∶1∶1∶1的試驗(yàn)，測定其纖維素酶活為6.91 U/ml，此值大于正交試驗(yàn)的任何結(jié)果。

2.3 固體復(fù)合微生物菌劑的制備

按照最優(yōu)配比制得固體復(fù)合微生物菌劑，菌劑為暗黃色，帶有腥味。

2.4 復(fù)合微生物菌劑菌數(shù)測定

通過平板計(jì)數(shù)法，測得復(fù)合微生物菌劑中的微生物數(shù)目為3 cfu（108/g）>2 cfu，符合《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 202872006）的要求。

3 結(jié)論與討論

（1）試驗(yàn)中細(xì)菌的生長停滯期較短，對數(shù)期來臨較早且持續(xù)時(shí)間短，一般12 h內(nèi)便可完成細(xì)菌對數(shù)期的生長過程。放線菌的遲緩期較長，對數(shù)生長期來的晚，且持續(xù)時(shí)間長，增速也比細(xì)菌慢。

（2）在確定菌種轉(zhuǎn)移的時(shí)間時(shí)，試驗(yàn)采取了對數(shù)期末、穩(wěn)定期前的時(shí)間，主要是由于此時(shí)單個(gè)微生物的生長速率較快，并且活菌數(shù)達(dá)到較大值。

（3）通過正交試驗(yàn)確定復(fù)合微生物菌劑的配比，可以大大減少試驗(yàn)的工作量。從各因素極差可以看出，HP2菌的所占比例為主導(dǎo)因素。最終正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果顯示，各菌種最佳配比為TG1∶P3∶HP2∶HN1=3∶1∶1∶1。

參考文獻(xiàn)

[1]

章明奎.畜禽糞便資源化循環(huán)利用的模式和技術(shù)[J].資源與環(huán)境科學(xué)，2010（14）：280-283.

[2] 李天樞.畜糞堆肥高效復(fù)合微生物菌劑的研制與應(yīng)用[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[3] 沈德龍，李俊，姜昕，等.GB 202872006，農(nóng)用微生物菌劑[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[4] 關(guān)大偉，陳慧君，李俊，等.NY/T 18472010，微生物肥料生產(chǎn)菌株質(zhì)量評價(jià)通用技術(shù)要求[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.