榛屬植物多酚提取方法的研究

李修平等

摘要植物多酚具有極強的抗氧化、抑菌、抗炎、防輻射、降血壓等生理活性。為有效開發利用東北野生榛屬資源，以東北野生平榛、毛榛為試驗材料，以榛葉為提取對象，采用溶劑萃取法超聲波輔助處理的提取方法，對2種榛屬多酚進行提取分離，以確定榛屬多酚提取分離最優方法。通過單因素試驗及正交試驗獲得的最佳提取條件為：80%乙醇作為提取劑，料液比為1∶14 g/ml，75 ℃，浸提3 h，浸提2次，超聲波輔助40 min。在此條件下榛葉總多酚得率為2.565 6%。取材上，平榛與毛榛間差異不顯著，但取材時間上差異顯著，8月取材總多酚得率最高。

關鍵詞榛屬植物；多酚；提取方法

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）21-282-04

我國東北榛屬植物以平榛、毛榛為主[1]，分布廣泛，資源豐富，但大多處于野生狀態，且這類榛樹存在果實小、果殼厚、出仁率低等缺點，未對其進行良好的加工和利用，附加值相當低[2-4]。植物多酚具有極強的抗氧化、酶活性抑制、抑菌、抗致突變、抗炎、防輻射、降血壓、抗癌等活性[5-7]。目前國內還未對榛子中的多酚進行開發利用，因此，從資源豐富的東北野生榛屬植物中提取多酚物質并開發利用具有重要的意義。

多酚提取的報道多集中在茶葉、水果等植物中[8-12]，對于從榛葉中提取報道較少[13-15]，因此對榛葉多酚提取的方法進行研究，對于有效開發利用東北野生榛屬植物具有重要意義。溶劑萃取法是多酚提取常用的方法，超聲波法已經在多種有機成分提取中被廣泛應用[16-17]，將其作為輔助手段應用于榛葉多酚的溶劑萃取工藝中，有利于提高提取效果，獲得可進行工業化生產的提取工藝。

筆者以東北野生平榛、毛榛為試驗材料，以榛葉為提取對象，采用溶劑萃取法加以超聲波輔助的提取方法，對2種榛屬多酚進行提取分離，確定榛屬多酚提取分離最優方法，為有效開發利用東北野生榛屬資源提供技術方法。

1材料與方法

1.1材料

以采自佳木斯大學榛子種植圃的東北平榛和毛榛為試驗材料，分別于6、7、8月進行榛葉的采集。將葉片干燥，粉碎，備用。

1.2方法

1.2.1榛葉多酚提取方法。

采集榛子葉→將榛葉置于密封袋內利用硅膠粒吸干→粉碎→ 浸提→過濾→獲得榛葉多酚粗提液，將粗提液定容，利用比色法來測定吸光度，然后計算榛葉多酚得率。再然后進行旋轉蒸發→在60 ℃下烘干→獲得總多酚干樣。

1.2.2標準曲線的確定。

稱取干沒食子酸 0.5 g，溶解于水中并定容至100 ml，獲得0.5% 母液。分別取沒食子酸母液0、0.5、1.0、1.5、2.5 ml，置于 50 ml容量瓶中稀釋。再分別吸取上述稀釋后溶液 0.5 ml，各加水 20 ml，福林-肖卡試劑5 ml，混合均勻，各加入20% 碳酸鈉溶液15 ml，混和均勻后定容至 50 ml。將上述溶液于 20 ℃下靜置2 h，然后測定756 nm波長下的吸光度[18]。繪制標準曲線并進行回歸處理，得回歸標準曲線方程為：y=4.984 6x+0.066 4（其中，x為沒食子酸標準溶液，mg/ml；y為波長760 nm 處測定吸光度值），R2=0.980 4。

1.2.3榛葉總多酚含量的測定方法。

將榛葉干燥、粉碎，稱取1.5 g，使用溶劑浸提法處理后，過濾提取液，并收集榛葉多酚粗提液，向上述粗提液0.5 ml中加入20 ml水，5 ml福林-酚試劑，混合均勻，然后迅速（30～480 s）加入20% 碳酸鈉溶液15 ml，混合均勻，然后用水定容至50 ml。將上述溶液在溫度為 20 ℃的條件下，靜置 2 h，測定765 nm 波長下的吸光度，然后代入回歸方程，求榛葉多酚粗提液中總多酚類物質的含量，同時做 2 次平行試驗。按照下列公式計算總多酚得率：

總多酚得率% =C×50×V1m×V2 ×106× 100

式中，C為總多酚質量濃度（mg/ml）；50為提取液定容體積（ml）；V1為按一定料液比所得體積（ml）；V2為吸取提取液體積 （ml） ；m為原料質量（g）[18]。

1.2.4榛葉總多酚提取最佳溶劑的確定。

以乙醇、甲醇、丙酮3種溶劑做提取劑，體積分數分別設定為40%、50%、60%、70%、80%，提取溫度為60 ℃，設定料液比為1∶10 g/ml，提取時間為2 h，3次重復。提取方法與總多酚含量測定方法如前所述，確定適宜的提取溶劑。

1.2.5溶劑萃取法工藝優化。

稱取榛葉粉末1.5 g（準確至0.000 1 g），放入150 ml錐形瓶中，研究料液比、浸提溫度、時間、次數及超聲波輔助對榛葉總多酚含量的影響進行單因素試驗，并在此基礎上進行正交試驗。

1.2.5.1料液比對榛葉中總多酚提取效果的影響。

稱取15 g（準確至0.000 1 g）榛葉粉末樣品，提取條件為70%乙醇溶液作為提取溶劑，提取溫度為60 ℃，提取時間為2 h，料液比設置1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/ml 5個處理，3次重復。提取方法與總多酚含量測定方法如前所述，并計算出粗提液中總多酚得率。

1.2.5.2浸提溫度對榛葉中總多酚提取效果的影響。

稱取1.5 g（準確至0.000 1 g）榛葉粉末樣品，提取條件為70%乙醇溶液作為提取溶劑，料液比為1∶10 g/ml，提取時間2 h，提取溫度設置40、50、60、70、80 ℃ 5個處理，3次重復。提取方法與總多酚含量測定方法如前所述，并計算出粗提液中總多酚得率。

1.2.5.3浸提時間對榛葉中總多酚提取效果的影響。

稱取1.5 g（準確至0.000 1 g）榛葉粉末樣品，提取條件為70%乙醇溶液作為提取溶劑，料液比 1∶10 g/ml，提取溫度為60 ℃，提取時間設1、2和3 h 3個處理，3次重復。提取方法與總多酚含量測定方法如前所述，并計算出粗提液中總多酚得率。

安徽農業科學2015年

1.2.5.4浸提次數對榛葉中總多酚提取效果的影響。

稱取1.5 g（準確至0.000 1 g）榛葉粉末樣品，提取條件為70%乙醇溶液作為提取溶劑，提取溫度60 ℃，料液比1∶10 g/ml，提取時間1 h的提取條件，分別對樣本進行1、2、3次提取 3個處理，3次重復。提取方法與總多酚含量測定方法如前所述，并計算出粗提液中總多酚得率。

1.2.5.5超聲波處理時間對榛葉中總多酚提取效果的影響。

榛葉粉末樣品1.5 g（準確至0.000 1 g），提取條件根據上述單因素試驗最佳條件進行，超聲波處理時間分別設置20、30、40、50 min 4個處理，3次重復。提取方法與總多酚含量測定方法如前所述，并計算出粗提液中總多酚得率。

1.2.6不同采集時期對榛屬葉片多酚提取的影響研究。

在溫度為75 ℃，料液比1∶14 g/ml，乙醇濃度80%，提取時間為2 h的條件，分別對6、7、8月份采集的平榛、毛榛葉片進行榛葉總多酚提取，3次重復。提取方法與總多酚含量測定方法如前所述，并計算出粗提液中總多酚得率。

2結果與分析

2.1榛葉多酚提取的單因素試驗研究

2.1.1榛葉中總多酚最佳提取劑的確定。

甲醇、乙醇、丙酮作為提取劑，設置5個提取分數進行多酚提取，計算總多酚得率，結果見圖1。

圖1結果顯示，40%丙酮總多酚得率最高，其次是80%甲醇，再次為70%乙醇，其總多酚得率分別為1.805%、1603%和1.438%，最佳提取劑為40%丙酮。但考慮工業化生產的成本和安全性，該研究選用了價格低廉、安全性高的70%乙醇作為提取劑。

2.1.2料液比對榛葉總多酚提取效果的影響。

設置了6種料液比處理，對不同料液比對榛葉總多酚提取效果的影響進行了分析，結果見圖2。

圖2結果顯示，料液比在1∶15 g/ml時總多酚得率最高為2.032 1%，隨著料液比中溶劑的增加總多酚得率增加，料液比1∶15 g/ml時達到最大值，之后隨著料液比中溶劑的增加總多酚得率下降，故最佳提取料液比為1∶15 g/ml。

2.1.3浸提溫度對榛葉中總多酚提取效果的影響。

在浸提溫度分別為40、50、60、70和80 ℃時，分析了浸提溫度對榛葉總多酚得率的影響，結果見圖3。

圖3顯示，隨著浸提溫度的升高，總多酚得率呈上升趨勢，浸提溫度80 ℃時總多酚得率為最高值（1.686 4%），所以最佳浸提溫度為80 ℃。

2.1.4浸提時間對榛葉中總多酚提取效果的影響。

設置3個浸提時間處理，計算榛葉總多酚得率，結果見圖4。

由圖4可知，隨著浸提時間的延長，總多酚得率不斷增加，浸提3 h時獲得總多酚得率最高，為1.377 4%。

2.1.5浸提次數對榛葉中總多酚提取效果的影響。

對試驗材料進行1、2、3次浸提萃取，計算其總多酚得率，結果見圖5。

圖5顯示，隨著浸提次數的增加，總多酚得率不斷下降，第1次浸提總多酚得率為1.329 9%，第2次浸提總多酚得率為1.235 7%，第3次浸提總多酚得率為0.850 5%，考慮成本與環境污染，建議浸提萃取2次，總多酚得率為2.565 6%。

2.1.6超聲波輔助提取對提取效果的影響。

提取條件根據上述試驗選擇單因素試驗中最佳條件進行提取，為70%乙醇溶液作為提取溶劑，料液比1∶20 g/ml，提取溫度80 ℃，提取時間3 h，超聲波處理時間分別設置20、30、40、50 min 4個處理，3次重復，試驗結果見圖6。

由圖6可知，隨著超聲波輔助提取時間的增加，總多酚得率不斷增加，當處理時間為40 min時，總多酚得率最高，之后隨著處理時間的延長，總多酚得率不斷下降，故選40 min的超聲波輔助提取為該試驗的最佳輔助處理時間。

2.2榛子多酚提取的正交試驗研究

選定提取溫度、提取溶劑體積分數及料液比作為溶劑提取法中的主要因素進行 L9（33）正交試驗[19]，其中正交試驗因素水平設計見表1，結果見表2。以確定該方法的最佳因素組合。提取材料為榛屬（平榛、毛榛）葉片

由表2可知，各因子對提取效果影響大小順序為（極差R的大小順序）提取溫度、料液比、溶劑體積分數；最佳提取因素組合為（按因素順序每一因素K值最大的為最佳值）A1C1B3即提取溫度75 ℃，料液比為1∶14 g/ml，溶劑體積分數為80%乙醇。

2.3不同采集時期對榛屬葉片多酚提取的影響

分別對6、7、8月份的平榛、毛榛葉片進行多酚提取，以確定不同采集時期及不同種屬間榛葉多總多酚提取的影響，結果見圖7。

圖7顯示，6月和7月取材的榛葉所獲總多酚得率差別不大，8月取材的毛榛比平榛的總多酚得率稍高。對平榛和毛榛材料，在不同取材時間的總多酚得率進行了雙因素方差分析，

結果顯示，榛屬間F為4.430<4.747（F0.05），表明毛榛與平榛直接差異不顯著，月份間F為6.827>3.885 7（F0.05），表明取材月份間差異顯著，榛屬與月份間的交互作用差異不顯著，F為2.404>3.885（F0.05）。

3討論

3.1最佳提取劑的選取

雖然該研究中40%丙酮做提取劑時的總多酚得率最高，但是，該試驗的目的是研究多酚提取的最佳方法并應用于大規模生產，由于丙酮有毒，既對人體健康不利，且對環境危害甚大，所以丙酮不適合作為最佳提取劑。甲醇和乙醇相比較下，乙醇比甲醇成本更低，且來源更廣泛。所以，在生產中選用乙醇做提取劑更切合實際，以應用于工業化成產。乙醇在不同植物的多酚提取中是常用的提取劑[20-22]，田志琴在小米多酚活性物質的提取中將乙醇作為提取劑[23]，與該研究的提取劑選擇相同。

3.2榛葉多酚提取工藝的確定及改進

鑒于多酚物質的抗癌、抗氧化、抗動脈硬化、防治冠心病與中風等心腦血管疾病以及抗菌等多種生理功能，研究者們進行了大量的從多種植物中提取多酚的工藝和提取方法的研究[8-12]，但進行榛葉多酚提取方法和工藝優化的研究鮮有報道。該研究將提取方法確定為溶劑萃取法輔助超聲波處理，提取流程為榛葉→烘干→粉碎→ 浸提→超聲波處理→過濾→得到榛葉提取液→旋轉蒸發→烘干（60 ℃）→總多酚干樣獲得。經過2次浸提萃取，總多酚得率為2.565 6%，該研究所得粗提物并不能直接應用，應進行提取方法的進一步優化和探索并進行純化以

滿足科研和商品化生產的要求。

參考文獻

[1] 王艷梅，馬天曉，翟明普.榛子遺傳多樣性研究進展[J].北方園藝，2008（4）：91-95.

[2] 紀國鋒，梁傳和，戚繼忠.中國東北地區野生榛林的群落特征與經營[J].北華大學學報：自然科學版，2001（5）：431-434.

[3] 侯智霞，原牡丹，劉雪，等.我國榛子生產研究概況[J].經濟林研究，2008，26（2）：123-126.

[4] 龍作義，魯昌.黑龍江省榛子資源分布狀況與開發利用研究的進展[J].中國林副特產，2005（4）：41-42.

[5] 李健，楊昌鵬，李群，等.植物多酚的應用研究進展[J].廣西輕工業，2008（12）：1-3.

[6] 魯玉妙，馬慧.植物多酚SCI文獻計量及生物活性研究熱點分析[J].食品科學，2013，34（23）：375-383.

[7] 李昊陽，夏繼橋，楊連玉，等.植物多酚的抗氧化能力及其在動物生產中的應用[J].動物營養學報，2013，25（11）：2529-2534.

[8] 易運紅，張敏娟，呂君亮，等.茶與葡萄皮總多酚的提取、純化及抗氧化活性[J/OL].食品工業科技，http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20141124.1600.027.html.

[9] 付婧，岳田利，袁亞宏，等.真空耦合超聲提取茶多酚的工藝研究[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2013，41（3）：172-178.

[10] 岳亞楠，岳田利，袁亞宏.超高壓提取蘋果渣中多酚的研究[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2013，41（3）：179-186.

[11] 段宙位，竇志浩，何艾，等.青金桔皮中多酚的提取及其抗氧化性研究[J/OL].食品工業科技，http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20150105.1551.004.html.

[12] 王偉.蘋果渣中多酚的提取及抗氧化性研究[J].陜西理工學院學報：自然科學版，2014，30（6）：55-60.

[13] ANDREONI N.Separation of hazelnut phenolic substances[J].Acta Horticulturae（ISHS），2001，556：393-396.

[14] DEL RIO D，CALANI L，DALL'ASTA M，et al.Polyphenolic composition of hazelnut skin[J].Agricultural and Food Chemistry，2011，59：9935-9941.

[15] 李明，金哲雄.榛子葉多酚對小鼠皮膚膠原蛋白含量影響的研究[J].黑龍江醫藥，2006，19（1）：40-41.

[16] 姚瑞祺.植物多酚提取分離方法研究進展[J].農產品加工（學刊），2011（5）：84-85.

[17] 陳亮，李醫明，陳凱先，等.植物多酚類成分提取分離研究進展[J].中草藥，2013，44（11）：1501-1507.

[18] 杜彬，王同坤，侯文.板栗花中總多酚提取工藝優化[J].食品科學，2011，32（16）：121-126.

[19] 袁志發，周靜芋.實驗設計與分析[M].北京：高等教育出版社，2000：292.

[20] 趙玉紅，翟亞楠，王振宇.樟子松樹皮中松多酚的提取工藝研究及提取方法的比較[J].食品工業科技，2013（4）：304-309.

[21] 汪成東，張振文，宋士任.葡萄多酚物質提取方法的研究[J].西北植物學報，2004，24（11）：2131-2135.

[22] 杜運平，徐浩，張宗和，等.板栗苞多酚提取條件的研究[J].安徽農業科學，2011，39（2）：828-829.

[23] 田志琴.小米多酚類活性物質的提取及抗氧化性研究[D].鄭州：河南工業大學，2011.