維生素B12對牛冷凍精液品質的影響

檀磊

【摘 要】人工授精是發揮優秀公畜遺傳潛力的重要現代動物生物技術，而冷凍精液正是為了提供人工授精所需精子產品的一種精子庫。由卵黃、蔗糖、檸檬酸鈉、甘油和抑菌物質所組成的稀釋液對精子起到一定的保護作用。但是，在精子的冷凍-解凍過程中，容易發生過氧化反應，導致精液品質下降。本研究在用卵黃、蔗糖、檸檬酸鈉、甘油和抑菌物質配制好的精液稀釋液里面分別添加0.00%（對照）、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%的VB12進行試驗，解凍后評定精子運動特性、精子活力、頂體完整率、質膜完整性等指標。結果表明：稀釋液中添加0.50%維生素B12效果最好，其精子活力、頂體完整率、質膜完整性等明顯高于其他組（P<0.01）。

【關鍵詞】奶牛；冷凍精液；維生素B12；精液品質

0.前言

人工授精技術和冷凍精液的應用極大的推動了畜牧業的發展和良種的推廣。現在冷凍精液制造技術也日漸成熟，凍精品質得到了很大的提高，冷凍精液已經成了現在養牛業生產所不可缺少的部分，對養牛業的發展至關重要。但是精液在冷凍—解凍過程中還是不可避免的會與活性氧化物接觸，致使精子發生過氧化反應，冷凍精液的品質降低。本試驗添加不同量的維生素B12，利用偉力彩色精子質量分析系統，檢測精子的運動特性，同時檢測精子頂體完整率和質膜完整性，精確的分析精液品質，為現代化冷凍精液生產提供依據。

1.材料與方法

1.1試驗動物

試驗動物用陜西省家畜改良站飼養的成年、體質健康、性欲旺盛、采精頻率正常的荷斯坦公牛，并且每次試驗從飼養的所有荷斯坦奶牛所采的精液隨機取用一頭牛的精液實驗。

1.2精液稀釋液的配制

每種類型稀釋液配制100ml，所需要加入的各種試劑量，如表1所示

1.3 精液的冷凍前處理

1.3.1 精液稀釋

試驗采用一步稀釋法對精液進行稀釋。在稀釋精液前要將稀釋液放在水浴箱中預熱，使稀釋液溫度保持在32-35℃，這樣加入精液之后精子受的損傷會減小。

試驗中一般將精液密度保持在1.5x108/ml左右，不應過高，這樣有利于解凍后精子活力的檢測。

1.3.2精液分裝

把稀釋好的精液送到精液分裝的地方，利用全自動精子細管分裝儀進行裝管，封口，印號，并應該把裝好的細管及時地放進恒溫平衡儀。

1.3.3精液平衡

精液在冷凍過程中冰晶化過程對精子的損傷最為嚴重，精液平衡的目的是為了讓精液的溫度緩慢的下降到始凍溫度并且讓甘油充分的進入精子細胞，起到甘油的抗凍保護作用，因此平衡的好壞直接影響冷凍過程中冰晶化過程對精子的傷害。在精液自動平衡儀中，溫度設定為4℃，儀器蓋好放置3h讓精液的溫度由室溫緩慢的降到4℃，為精液的冷凍保存作好準備。

1.4 精液冷凍和解凍

1.4.1精液冷凍

精液冷凍時主要是在0到-15℃這一過程的冰晶化過程對精子的傷害，因而冷凍過程中應該極力避免這一過程，讓這一過程的時間盡量的縮短。本試驗所用的全自動冷凍儀從4℃開始冷凍，能夠在7′12″內把溫度降低到-140℃，這樣就極大地縮短了冰晶化過程的時間，使精液的傷害降到最小。冷凍好的精液應該迅速的從冷凍儀里面取出來用小布袋進行分裝，并且迅速的浸泡在液氮中保存。

1.4.2精液解凍

本試驗采用37.8℃的水溫進行解凍30s，從液氮罐中迅速的取出里面冷凍好的細管，并且快速的投入到水中進行解凍，整個過程必須迅速完成。解凍好的細管拿出來用干凈的紗布擦干，等待檢查。

1.5凍后精液品質檢查

1.5.1精子運動特性檢查

利用偉力彩色精子質量分析系統可以得到精子的運動特性，包括直線運動速度、曲線速度、平均路徑速度、鞭打頻率、側擺幅度。并且能夠得到a級、b級、c級、d級精子數和所占的百分率（a級精子為快速前向運動精子、b級精子為慢速前向運動精子、c級精子為非前向運動精子、d級精子為不動精子）。這些數據可以很好的描述精子的運動狀態，為精確分析精液的品質提供參考依據。

1.5.2精子活力的測定

采用平板壓片法，取一滴精液（10μl）于預熱（38℃）的載玻片上，蓋上蓋玻片，400倍下鏡檢，估測活力。也可以利用計算機輔助分析系統來進行檢測以得出比較準確的數值。

1.5.3 頂體完整率的檢查

配制姬姆薩染液并且染色制片（染液配制和制片方法見附錄），在相差顯微鏡1000倍鏡下隨機計算5個視野的精子，計算頂體完整率。

頂體完整率=頂體完整精子數/總精子數

1.5.4 質膜完整性的檢查

采用低滲腫脹法，取50μl精液加入1ml低滲液（37℃預熱）中，37℃恒溫水浴30min。取一滴（20μl）混合液于血細胞計數板上，40X下觀察5個視野，鏡檢計數200個精子，計算彎尾精子的百分率（精子質膜如果是完整的話精子的通透性比較好，這樣液體滲入精子會卷尾）。

質膜完整率（%）=彎尾精子數/精子總數×100%

1.6數據處理

論文所得數據全部用平均數加減標準差來表示，實驗所得數據利用SPSS11.5軟件進行方差分析。

2.結果與分析

2.1精子運動特性測定結果

通過偉力彩色精子質量分析檢測系統測定精子的運動特性，用試驗做好的細管冷凍精液，隨機抽取解凍10支細管作為重復，觀測精子的運動特性，試驗結果如表2和表3所示。

對于解凍精液中精子的運動情況，以及各種運動類型精子所占的比率，得到如表3所示得數據。

由表2可知，0.5%組精子的運動速度包括直線速度、曲線速度、平均路徑速度這些都明顯高于其他幾組。與對照組相比0.5%組高于對照組（P<0.01），0.75%組也高于對照組（P<0.05），0.25%組和對照組沒有明顯的差別，但是1%組的效果明顯降低，低于對照組。側擺幅度各組沒有明顯的差別。鞭打頻率0.5%組和0.75%組低于對照組，0.25%組和對照沒有明顯的差別，1%組高于對照組。

由表3可知，精子的運動情況，其中a類型和b類型的精子數量越多，占的比例越大，則就說明精子的活力越高。試驗中添加了0.5%組維生素B12的冷凍精液其a+b類型的精子比率明顯高于對照組（P<0.01），而0.75%組也高于對照組（P<0.05），1%組低于對照組（P<0.05），0.25%組和對照組沒有明顯差別，由此證明了0.5%的添加量為最合適的添加量。

2.2精子活力、頂體完整率、質膜完整性的測定結果

添加不同濃度維生素B12的稀釋液對牛冷凍精液精子活力，頂體完整率，質膜完整性均有不同的影響，試驗各組的精子活力均高于30%達到了人工授精的標準，但是與對照組相比較。如下表4、表5和表6所示：

試驗隨機用3頭牛的精液進行試驗，每次做5個重復。

上面的試驗數據表明，0.5%組精子活力、頂體完整率、質膜完整性，均遠高于對照組，差異極顯著（P<0.01）。而0.75%組其精子活力、頂體完整率、質膜完整性，也均高于對照組，差異顯著（P<0.05）。0.25%組和對照組沒有明顯的區別，差異不顯著，1%組的各個方面都低于對照組差異不顯著（P）0.05）。因此，0.5%的維生素B12添加量是最佳添加量，這和蔡吉光等人的研究結論一致。同時試驗結果表明精子的活力、質膜完整性和頂體完整率具有很高的相關性[14]。只有頂體完整的精子才具有活力，質膜也才可能完整。因而頂體完整率高于精子活力和質膜完整性。一般質膜完整性低于精子活力，因為有些質膜不完整的精子在短時間內也具有活性。

3.討論和結論

3.1關于維生素B12在冷凍精液稀釋液中保護作用機理

精液在冷凍過程中受到的傷害主要來源于兩個方面，其一是精液在冷凍—解凍過程中的冰晶化過程所帶來的不可逆的損傷。另一方面就是精子受到環境和精液中的活性氧化物的作用而發生過氧化反應，導致活力下降，精子畸形率等增加。

維生素B12又名鈷胺素，是含有金屬元素鈷的一類化合物，其生理活性在很大程度上取決于鈷，鈷能夠減少組織的耗氧量，從而提高機體對氧的耐受性，增加機體組織在缺氧環境中的活力。它在精液稀釋液中的保護機理目前研究還不很清楚，但研究者們都認為維生素B12的保護作用機理是：

維生素B12作牛的精液稀釋液可以提高解凍后的精子活力，一般認為，維生素B12的這一作用與其輔酶活性有關，維生素B12輔酶能使“氧化型（-S-S-型）輔酶A”還原成“還原型（-SH-型）輔酶A”，也可使-S-S- 型谷胱甘肽（glutathione，GSH）以及高胱氨酸還原為-SH型，而還原型的GSH對精細胞的代謝有非常重要的生物學活性；也有研究者發現，含維生素B12精清中的谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）釋放量明顯下降，認為這可能是提高精子活力的一個重要因素，因為在冷凍和解凍過程中，精子中的GOT就會釋放出來，從而導致精子的頂體腫脹和損壞，這一點能夠提高解凍后精子的頂體完整率，同時精子的畸形率也有明顯下降。

3.2關于冷凍-解凍后精液品質

到目前為止，已經有很多人試驗過在牛精液稀釋液里面添加維生素B12提高冷凍精液品質的研究。本試驗的數據表明，稀釋液中添加維生素B12在精子運動特性、精子活力、頂體完整率、質膜完整性這些方面都取的了較好的效果。并且研究最佳的添加量為0.5%（V/V），精子活力達到了53%，高于蔡吉光等的報道數據。

哺乳動物射出的精液不能馬上使卵子受精，精子必須在雌性動物的生殖道內“獲能”后，才具備授精能力。在精-卵受精時，精子要穿過透明帶，發生頂體反應，因此精子頂體的完整非常重要，為了有效的計算頂體完整率，本試驗采用姬姆薩染液染色后在顯微鏡下檢測，染色后的精子在顯微鏡下觀察非常清楚，每個重復隨機在顯微鏡的不同視野里面數200個精子，然后計算頂體完整率。試驗頂體完整率達到了67%，與孫淑琴等人的研究結果十分接近。

為了評估冷凍-解凍后精子質膜的完整性，本研究采用低滲膨脹試驗（HOST）進行檢測。HOST原理是，質膜完整的精（下轉第184頁）（上接第127頁）子在低滲溶液中由于滲透作用而發生膨脹，從而表現出卷尾狀態。水分由于滲透作用通過細胞膜進入細胞，重新構建了細胞內原有體液和細胞外液體之間的平衡體系。細胞體積增大，細胞膜擴張，引起鞭毛的卷曲。如果精子的質膜破損，則精子不能發生膨脹，也就不可能出現卷尾現象。在應用低滲腫脹試驗檢測精子質膜完整性時，HOST溶液的滲透壓應足夠低，既能最大限度的使精子質膜發生腫脹但又不能溶解精子細胞膜。在本研究中，溶液的滲透壓為 150mOsm/kg H2O，此時冷凍-解凍后精子質膜的完整率達到 51%，取得了理想的效果。

利用偉力彩色精子質量分析系統得到的精子運動特性，也充分的說明了0.5%維生素添加量是最合適的。通過精子的運動特征我們可以知道，精子的運動速度，運動方向和精子的活力具有很高的相關性，同時鞭打頻率和側擺幅度也和活力相關。向前運動精子比例高，精子運動速度快就表明精子活力高。同時各種運動精子側擺幅度基本相同沒有明顯的差異，而活力高的精子，在運動時鞭毛的擺動次數就少，而活力低的精子在運動時要耗費更多的能量，其鞭毛的擺動頻率就快。

4.小結

本試驗在由卵黃、蔗糖、檸檬酸鈉、甘油和抑菌物質配制好的精液稀釋液里面分別添加0.00%（對照）、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%的VB12進行試驗，解凍后評定精子運動特性、精子活力、頂體完整率、質膜完整性等指標，并用這些指標來評定精液品質。結果表明：在基礎稀釋液中添加0.50%維生素B12效果最好，其在精子運動特性、精子活力、頂體完整率、質膜完整性這些指標上都明顯高于其他組（P<0.01）。試驗研究的成功給實際生產冷凍精液提供數字依據，對我國的冷凍精液品質提高起到很大的推動作用，也為我國畜牧的發展奠定基礎。 [科]