應用RT—PCR方法檢測牛輪狀病毒的研究

李成元等

摘 要：牛輪狀病毒主要引起犢牛腹瀉，近年來，其國內感染率不斷增加，本研究參照牛輪狀病毒VP7基因序列，設計合成特異性檢測引物，通過RT-PCR反應條件的優(yōu)化，建立了檢測牛輪狀病毒的一步法RT-PCR方法，并應用該方法進行了臨床樣品的檢測。結果顯示，該方法具有良好的特異性、敏感性、重復性和臨床適用性。本研究為牛輪狀病毒的檢測提供了一種敏感、特異、快速、簡單的方法，具有很好的臨床應用價值，值得推廣應用。

關鍵詞：牛輪狀病毒；RT-PCR；檢測

Abstract： bovine rotavirus causes diarrhea in calves， in recent years， the infection rate is increasing， this study refers to the bovine rotavirus VP7 gene sequence， design and synthesis of specific primers， through the optimization of RT-PCR reaction conditions， established a one-step RT-PCR method for detection of bovine rotavirus， and application of the method for detection of clinical samples. The results showed that， the method has good specificity， sensitivity， reproducibility and clinical application. It provides a method for sensitive， specific， rapid， simple method for the detection of bovine rotavirus， which had good clinical application value， and it's worthy of popularization and application.

Keywords： bovine rotavirus； RT-PCR； detection

牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV）又稱犢牛腹瀉病毒（calfdiarrha virus），屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus），是引起犢牛急性腹瀉的主要病原之一，呈全世界范圍內流行，給全球養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經濟損失[1，2]。BRV主要感染1～7日齡的犢牛，可引起犢牛消化道機能紊亂，臨床上以精神沉郁、食欲廢絕、嘔吐、水樣腹瀉、嚴重脫水和酸中毒等為主要特征，嚴重的可以導致死亡，病死率高達50%，成年牛多呈隱性感染[3，4]，BRV感染后易繼發(fā)細菌性感染，可使病情進一步惡化[5]。近年來，國內BRV感染的陽性率不斷增加，對我國養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴重的影響和巨大的威脅[6]。RT-PCR技術操作簡單、檢測快速、敏感性高、特異性強，是目前動物疫病常用的分子生物學診斷技術，應用RT-PCR方法檢測BRV，有助于對臨床表現(xiàn)腹瀉癥狀的病牛進行快速確診，也有利于疾病的早期診斷和流行病學調查，為疾病的診斷提供更敏感、特異的方法。

1 材料和方法

1.1 病毒

牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）均由棗莊職業(yè)學院動物疫病檢驗檢疫中心實驗室保存。

1.2試劑、載體及試劑盒

Trizol試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；鼠源M-MLV反轉錄酶、Ribonuclease Inhibitor 購自生工生物工程（上海）股份有限公司。Ex Taq酶、dNTP為TaKaRa公司產品；病毒基因組RNA提取試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒購自百泰克科技（北京）有限公司。

1.3 病料處理

牛場送檢的腹瀉病料，用無菌研缽研磨并用PBS液（pH 7.2-7.4）5倍稀釋，分裝1.5 mL滅菌EP管，反復凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清待用。

1.4病毒基因組RNA/DNA的提取

按病毒基因組RNA提取試劑盒分別提取牛輪狀病毒（BRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCV）的基因組RNA、按病毒基因組DNA提取試劑盒提取牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）的基因組DNA，同時提取病料處理上清液的病毒基因組RNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5引物的設計與合成

根據GeneBank上公布的BRV毒株VP7基因組序列（登錄號：M63266.1），利用oligo6.0軟件設計并合成1對特異性檢測引物，BRVF1：5'-CTACGCAAA GTGAACCATT-3'；BRVR1：5'-ATAGAACGCTGACGAATTAAG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.6 RT-PCR擴增反應

1.6.1反轉錄合成cDNA 反轉錄反應按25 μL體系操作，取提取的RNA 10 μL，加入RNase free dH2O 0.5 μL，下游引物BRV R1 2.5 μL，10×M-MLV Buffer 2 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，dNTP 1 μL，M-MLV反轉錄酶1 μL，37 ℃作用50 min后95 ℃滅活5 min后用于PCR擴增。DNA病毒的基因組不用進行反轉錄直接進行PCR擴增。

1.6.2 RT-PCR條件的優(yōu)化

1.6.2.1 最適模板含量的確定 將反轉錄合成的cDNA適當稀釋，使其分別含有1 μg、0.1 μg、10 ng、

1 ng，分別以其為模板，確定最適模板含量。

1.6.2.2 最適引物含量的確立 在RT-PCR反應體系中分別加入上下游引物（20 μmol/L）各0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL、0.7 μL、0.9 μL，確定最適引物含量。

1.6.2.3 最適退火溫度的確立 分別取50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃為退火溫度進行RT-PCR擴增，確定最適退火溫度。

1.7特異性試驗

分別以提取的牛輪狀病毒（BRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCV）基因組RNA，牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）基因組DNA為模板，用已優(yōu)化的最佳反應條件進行檢測。

1.8敏感性試驗

將反轉錄合成的cDNA適當稀釋，使其分別含有0.1 μg、1 μg 、0.1 ng、1 ng、10 ng 的含量，分別以其為模板進行RT-PCR檢測，確定PCR擴增的敏感性。

1.9重復性試驗

用建立的RT-PCR方法分別對牛輪狀病毒（BRV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCV），牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）以及BRV 3份陽性和3份陰性樣品重復檢測3次，確定檢測方法的重復性。

1.10檢測方法的臨床應用

利用建立的BRV RT-PCR檢測方法檢測不同牛場的送檢22份臨床疑似BRV感染的犢牛腹瀉樣品和35份臨床組織病料，對RT-PCR擴增呈陽性的片段回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定。將測序結果進行BLAST序列比對，以驗證該檢測方法的準確性。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR反應條件的確定

經反應條件的優(yōu)化試驗確定RT-PCR的最適模板含量為0.1 μg，最適引物含量為10 μmol，最適退火溫度為52 ℃。確定RT-PCR反應體系為： 5 μL 10× PCR Buffer、4 μL dNTP（2.5 mmol/L）、上下游引物P1、P2（20 μmol/μL）各0.5 μL、0.1 μg cDNA，加水至50 μL。RT-PCR反應條件為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃終止反應。

2.2特異性試驗

如圖1所示，BRV的擴增產物在761 bp處出現(xiàn)特異性的擴增條帶，與試驗預期設計的大小相符。而BVDV、BCV、IBRV均未出現(xiàn)擴增產物，表明檢測方法具有良好的特異性。

2.3敏感性試驗

BRV的基因組RNA反轉錄合成的cDNA稀釋至10 ng的含量仍然有特異性擴增條帶，表明檢測方法具有良好的敏感性（圖2）。

2.4重復性試驗

將保存的病毒基因組RNA/DNA進行3次重復操作，試驗結果完全一致，說明該檢測方法有很好的重復性。

2.5檢測方法的臨床應用

應用該方法檢測22份疑似BRV感染的犢牛腹瀉樣品和35份臨床組織病料樣品，22份犢牛腹瀉樣品中16份為BRV陽性，陽性率達72.72 %（16/22），35份臨床組織病料樣品有6份為陽性，陽性率達17.14 %（6/35）。陽性RT-PCR擴增產物的測序結果經過BLAST序列比對，與BRV CHLY株（GenBank登錄號：DQ195152.1）的同源性均在99.6 %以上，表明建立的RT-PCR檢測方法有很好的準確性，值得臨床樣品檢測的推廣應用。

3 討論

BRV是引起牛腹瀉的重要病原之一，約50 %的犢牛腹瀉是由BRV感染引起，給牛場造成了巨大的經濟損失[7]。且輪狀病毒為人畜共患病毒，人感染輪狀病毒后也會引起腹瀉及發(fā)生胃腸炎，故加強BRV的綜合防控對養(yǎng)牛業(yè)和人類健康都具有十分重要的現(xiàn)實意義[8]。目前，BRV的檢測方法主要包括病毒分離、血清中和試驗、ELISA技術及PCR等方法。傳統(tǒng)的病毒分離和血清中和試驗方法，費時費力，并且由于BRV不容易在細胞中出現(xiàn)病變也影響結果的觀察；ELISA方法雖然靈敏度高，但受到病毒感染時間的限制，不能進行早期診斷；PCR方法敏感性高、特異性強，可以準確快速檢測出極低含量的BRV，且操作簡單、檢測快速[9]。因VP7基因是BRV的結構基因，具有高度的保守性，本研究選擇在VP7基因內部設計RT-PCR檢測引物，提高了BRV的檢出率，減少了漏檢的可能。本研究建立的BRV RT-PCR檢測方法具有良好的特異性、敏感性、重復性和穩(wěn)定性，將為BRV的病原檢測及分子流行病學調查等提供一種敏感、特異、快速、準確的分子生物學方法。 應用該方法檢測22份臨床疑似BRV感染的犢牛腹瀉樣品16份為陽性，35份臨床組織病料樣品6份為陽性，陽性率達17.14 %（6/35），該結果與常繼濤等[9]報道內蒙古、黑龍江、新疆、北京、安徽等地區(qū)BRV感染的平均陽性率為12 %具有高度的一致性，表明BRV在我國牛群中已普遍存在，建議加強對該病毒的診斷，及時淘汰感染牛，保障我國養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展。

（編輯：李雨慈）

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