P16蛋白在正常宮頸、CIN、宮頸癌組織中的表達差異及意義

鐘偉珍 唐忠慶 嚴敏莉

【摘? 要】目的：探討P16蛋白在正常宮頸、宮頸上皮內瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）、宮頸癌組織中的表達差異及意義。方法：收集本院2012年10月～2013年10月行除的宮頸癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（61例）組織的石蠟標本64例進行研究，并收集30例正常宮頸組織標本作為對照組。利用免疫組織化學技術對所有標本進行檢測，得出其中的P16蛋白表達情況。結果：在CIN組織和宮頸癌組織中，較之正常的宮頸組織，p16蛋白的陽性表達率顯著增加。而將宮頸癌組織與正常宮頸組織，以及正常宮頸組織和CIN組織，還有CIN組織與宮頸癌組織進行兩兩對比，可以發現不同組織的p16蛋白陽性表達率經比較均存在顯著差異。結論：16蛋白在正常宮頸、CIN以及宮頸癌組織中的表達存在較大的差異，臨床可以將16蛋白作為宮頸癌篩查的重要指標之一。

【關鍵詞】宮頸;宮頸上皮內瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）;宮頸癌;P16蛋白;表達

宮頸上皮內瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）是一組與宮頸癌關系較為密切的病變，研究發現，P16蛋白是一種抗癌基因，廣泛存在于人體的宮頸細胞之中，與宮頸上皮內瘤變等關系密切^[1]。一旦，P16蛋白發生變異，便會逐漸轉化為惡性細胞。因此，臨床積極對p16蛋白正常宮頸和CIN以及宮頸癌組織中的表達水平進行研究，可以幫助人們更好的了解疾病的發生與發展等，提高臨床治療的準確性，具有較強的現實意義^[2]。本研究中，筆者收集本院2012年10月～2013年10月行除的宮頸癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（一共61例）組織的石蠟標本64例進行研究，并收集30例正常宮頸組織標本作為對照組，探討P16蛋白在正常宮頸、CIN、宮頸癌組織中的表達差異及意義。現將研究結果進行如下報告。

1一般資料和方法

1.1一般資料

收集本院2012年10月～2013年10月行除的宮頸癌（3例）、CINⅡ、Ⅲ（61例）組織的石蠟標本64例進行研究，患者年齡23 ～ 59歲。另外，從同期在本院接受健康體檢的健康人群中收集30例正常宮頸組織標本作為對照組。研究獲得醫學倫理學相關部門同意，所有患者均了解研究相關情況，并簽署知情同意書，自愿參與研究。

1.2方法

利用免疫組織化學技術對所有標本進行檢測，分析其P16蛋白表達情況。

1.2.1試劑

（1）p16鼠抗人單克隆抗體購自上海天呈醫流科技股份有限公司;（2）超敏SP（鼠/兔）試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司;（3）AB酶底物顯色劑購自上海領潮生物科技有限公司;（4）PH 6.0枸櫞酸緩沖液（自配）（5）0.01MPH7.4 PBS緩沖液（自配）。

1.2.2儀器和設備

（1）醫用凈化工作臺購自北京東聯哈爾儀器制造有限公司;（2）單道可調式微量移液器購自上海艾研生物科技有限公司;（3）雙目光學顯微鏡購自上海明茲儀器有限公司;（4）推拿式切片機購自香港萬浩科技有限公司;（5）隔水式電熱恒溫培養箱購自上海璽恒實業有限公司;（6）生物組織攤烤片機購自湖北康益達醫療科技有限公司;

1.2.3檢測方法

將購買試劑時提供的p16陽性切片作為陽性對照，將購買磷酸鹽緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照。利用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接（S-P法）檢測不同組織中的p16表達情況。

1.3檢測結果判定標準

p16蛋白的蛋白產物位于細胞核或者細胞漿，如果為陽性，則呈黃色或棕黃色。計數：利用100倍顯微鏡，觀察每張切片 10個以上的獨立視野，選取其中陽性細胞數最多的5個視野，繼續利用400倍視野予以記數，將5個視野平均值作為最終結果。根據陽性細胞比例和分布情況進行判定：（1）陰性（-）：單個細胞染色，陽性細胞數小于5%，（2）弱陽性：（+）小的或散在細胞團染色，陽性細胞數5%～24%;（3）中度陽性（++）：簇狀或者片狀細胞染色，陽性細胞數25%～50%;（4）強陽性（+++）：彌散細胞染色，陽性細胞數在50%以上。（5）過表達。（++-+++）。本研究中，弱陽性表達以下均計為陰性，過表達視為陽性。

1.4統計學處理

研究所得數據均輸入Excel表格，并使用SPSS 公司推出的SPSS 15.0軟件進行統計分析，研究所得計數資料均進行Χ²檢驗，計量資料均進行t檢驗。并以P<0.05作為差異有統計學意義的標準。

2結果

經統計和檢測，p16蛋白在不同宮頸組織中的表達情況存在顯著差異，（P<0.05）。其中，在CIN組織和宮頸癌組織中，較之正常的宮頸組織，p16蛋白的陽性表達率顯著增加。而將宮頸癌組織與正常宮頸組織，以及正常宮頸組織和CIN組織，還有CIN組織與宮頸癌組織進行兩兩對比，可以發現不同組織的p16蛋白陽性表達率經比較均存在顯著差異。具體結果如表1所示：

表1? p16蛋白在宮頸組織中的表達情況分析

組織分類

例

p16蛋白

陰性（例）陽性（例）

陽性表達率（%）

P

正常組織

CIN

宮頸癌

30

61

3

30

43

1

0

18

2

0

29.5

66.7

/

<0.05

<0.05

3討論

當人體內出現失控性細胞增殖現象的時候，便會導致各種腫瘤的出現。腫瘤的出現受累于多重遺傳和表觀遺傳水平上的異常，在對各種腫瘤進行診治的時候，存在較大的難度^[3]。分析原因，是因為腫瘤的其基因組和表觀基因組在不同生物層面上具有極度的異質性，在水平上具有極強的可變性^[4]。另外，腫瘤還對各種環境都具有極強的適應性。因此，在對各種類型的腫瘤進行診斷和治療的過程中，便需要積極的利用各種新型的測序技術，利用各種高效的影像學手段，并尋找新型的分子標志物，以更好的掌握腫瘤發生和發展的相關問題，更好的指導臨床治療等。

3.1宮頸病變

宮頸癌是一種常見的惡性腫瘤，對女性的危害極大。經過大量的研究發現，宮頸上皮內瘤變（cervicalintraepithelialneoplasias，CIN）是一組與宮頸癌關系較為密切的病變。但是，從宮頸病變發展為宮頸癌需要較長的時間，過程較為緩慢^[5]。而且，很多患者在疾病的發生和發展過程并沒有表現出特異性的征兆，因此較易出現病情的延誤，錯失最佳治療時機。隨著臨床醫學研究水平的不斷提高，人們開始對 宮頸癌的發生發展和不同控制細胞的生長、分化的關系等進行研究，并分析腫瘤的發展是否與細胞基因受損之間存在一定的內在聯系。經過大量的研究人們發現，當不同控制細胞受到一定的損傷之后，便會激活機體內的癌基因，并導致各種抑癌基因的丟失或失活，從而引發腫瘤的出現。

3.2 p16蛋白

近年來，隨著現代細胞分子生物學理論和技術的發展，利用新的生物工程學技術，如克隆與序列分析、DNA重組、分子雜交、單抗和ELISA技術、PCR、限制性長度多態性分析和基因轉染等對宮頸癌的癌變過程進行了大量的研究工作。研究發現，宮頸癌的發展過程中，抗癌基因有p53、p16等，以點突變和缺失為主^[6]。這些異常基因在癌變過程的不同時期影響細胞異型增生，癌細胞的分化程度、浸潤和轉移。p16基因的缺失或表達水平低下以及p53點突變或缺失者癌細胞分化程度低，浸潤和轉移能力強，故與惡性表型相關。在卵巢癌、子宮頸癌和子宮內膜癌等婦科惡性腫瘤中，均存在p16基因的表達異常^[7]。p16蛋白是一種細胞周期負調控蛋白，又被稱為p16/CDKN2基因或者多種瘤抑制因子I（MTS-1）。p16蛋白可以指令細胞停止分裂，發揮出較強的抵御癌癥的作用，有效阻擊癌細胞，使之停止分裂^[8]。p16蛋白可以有效抑制細胞周期蛋白依賴性激酶，因此對細胞的整個周期過程發揮出較強的“減速”作用。在具體的作用過程中，p16可以積極的與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）產生特異性的結合，導致其失活^[9]。于是進一步發揮出對細胞周期的反向調節效應，達到“減速”的目的。一旦p16蛋白受到各種因素的影響，出現較強的變異現象，便會對細胞的增殖周期產生較大的影響，導致其出現失控，于是細胞便會呈現出無限生長的情況^[10]。

3.3 p16蛋白與宮頸疾病

大量的研究發現，在各種婦科惡性腫瘤例如宮頸癌中，存在較為明顯的p16蛋白異常表達的情況^[11，12]。p16蛋白的異常變化包括了多種類型，例如p16蛋白啟動子甲基化和染色體異位以及體細胞突變和基因缺失。不同的因素影響下，均會導致 p16蛋白的異常表達。例如，如果出現p16蛋白啟動子甲基化，則會導致基因出現沉默繼而基失活，引發宮頸癌。研究發現，在不同病變性質的宮頸組織中，p16 蛋白的表達均會出現不同表達情況^[13]。還有學者經過研究報道，p16蛋白的陽性表達情況和宮頸癌的臨床分期之間呈現出明顯的正相關關系。其中，宮頸癌Ⅲ期和Ⅳ期病理患者的p16蛋白的陽性表達程度顯著低于宮頸癌Ⅰ期、Ⅱ期病理患者^[16]。汪勤^[14]等通過利用免疫組化SP法檢測正常子宮頸或炎性病變組織、CIN1～3中的p16蛋白表達情況發現，p16 蛋白表達和子宮頸上皮內瘤變的病變進展之間存在十分密切的聯系，因此，通過對檢測p16蛋白的表達水平，可以更好的對 臨床CIN進行分級診斷，具有一定的臨床應用價值。經過大量的研究，學者們普遍認為p16蛋白的實際表達情況和宮頸疾病之間存在較為密切的聯系^[15，16]。本研究最終結果顯示，在CIN組織和宮頸癌組織中，較之正常的宮頸組織，p16蛋白的陽性表達率顯著增加。而將宮頸癌組織與正常宮頸組織，以及正常宮頸組織和CIN組織，還有CIN組織與宮頸癌組織進行兩兩對比，可以發現不同組織的p16蛋白陽性表達率經比較均存在顯著差異。即提示，在正常宮頸、CIN以及宮頸癌組織中，p16蛋白的表達存在較為明顯的差異。與其他一些學者的研究結果進行比較，基本一致。

另外，徐東曉等^[17]經過研究發現，在增生期子宮內膜、單純型增生過長、復雜型增生過長、非典型增生過長和子宮內膜癌中，p16蛋白的表達情況呈現出依次下降的情況。其中，在p16蛋白的實際表達方面，增生期子宮內膜和子宮內膜癌之間存在顯著差異（P<0.05）。研究還發現，p16蛋白在子宮內膜癌中表達在淋巴結轉移不同情況以及不同組織學分級的組別之中也存在較大的差異，（均P<0.05）。最終，研究學者提出觀點，認為p16蛋白 的表達和子宮內膜癌的發生發展之間存在一定的關系，并可以積極的應用對子宮內膜癌的預后之中。但是，受到本研究樣本容量和觀察時間的影響，對于 p16 和宮頸癌預后之間的關系以及臨床應用價值等，并沒有予以進一步的研究。因此，本研究還存在一定不足之處。進一步的結果，還需要在今后的研究中不斷擴大樣本容量，延長研究時間，增加觀察指標等，予以進一步的分析探討。

綜上所述，p16蛋白在正常宮頸、CIN以及宮頸癌組織中的表達呈現出較大的差異。其中，p16蛋白的陽性表達發生在宮頸癌和癌前病變整個階段。因此，對p16蛋白陽性表達的檢測，可以積極的應用于臨床對宮頸癌的篩查和診斷之中。所以，在今后的林從檢測過程中，可以積極的將p16蛋白作為一種特殊的腫瘤標記物進行檢測，以更好的提高診斷效果，指導臨床治療。

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