牛卵丘卵母細胞體外成熟的研究進展

丁麗艷

摘要：牛體外受精技術是胚胎生物工程技術研究的基礎，其中牛卵丘卵母細胞體外成熟培養(yǎng)是體外受精技術的關鍵，也是重要環(huán)節(jié)。自上世紀三十年代以來，國內外研究者們都付出了大量的研究工作，并取得了較大研究進展。目前，牛卵丘卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系已經確立，但其中的卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育阻滯，卵母細胞的成熟調控機理等問題，還有待研究者們進一步深入探討。本文主要從牛卵丘卵母細胞的獲得方法、體外培養(yǎng)條件、體外培養(yǎng)液及添加物、存在問題等幾方面來綜述其研究進展。

關鍵詞：牛；卵丘卵母細胞；體外培養(yǎng)

牛卵丘母細胞體外成熟是在牛體外模擬卵泡環(huán)境，進而誘發(fā)未成熟卵母細胞成熟的一項生物技術。其是牛體外受精（IVF）的基礎，也是重要環(huán)節(jié)之一，牛卵丘卵母細胞的體外成熟質量直接影響其體外受精效果，甚至是影響出生牛犢的質量。本文就牛卵丘卵母細胞體外成熟研究現(xiàn)狀、研究方法、體外成熟的判定和存在問題等進行論述。

1 研究現(xiàn)狀

有關專家于1935年利用兔卵泡中分離出來的卵丘卵母細胞進行體外培養(yǎng)，經成功減數(shù)分裂后，完成了兔卵丘卵母細胞的體外成熟過程。此后，哺乳動物的卵丘卵母細胞體外成熟培養(yǎng)技術得到了迅猛發(fā)展。目前，卵丘卵母細胞的體外成熟技術已被廣泛應用于科學研究、醫(yī)學生殖工程和畜牧生產中。牛未成熟卵母細胞經體外培養(yǎng)，體外成熟率可達90%以上。然而，體外成熟卵母細胞的質量和發(fā)育潛能與體內成熟的卵母細胞相比仍有較大差距，體外成熟的卵母細胞存在細胞質成熟差或者細胞核和細胞質成熟并不同步等問題。針對目前牛體外受精研究中出現(xiàn)的問題，有關專家認為，牛卵丘卵母細胞在成熟過程中退化以及細胞質不完全成熟是造成其體外受精胚胎生產效率低的主要原因。

2 研究方法及進展

2.1 牛卵丘卵母細胞的獲得

2.1.1 從廢棄的牛卵巢中獲得

即運用切割法或抽吸法等機械分離法從屠宰場廢棄的牛卵巢上獲取未成熟的卵母細胞。將收集卵巢置于25～35℃的生理鹽水中，添加抗生素，3小時內運回實驗室。將術者的手和母牛的卵巢消毒后，將卵巢上多余的肉割掉，用裝有18號針頭的5毫升注射器，從卵巢表面直徑為2～6毫米卵泡中抽取卵母細胞，也可用消毒的手術刀片切割卵巢，回收卵母細胞。

此方法中卵巢保存溫度對卵母細胞的質量影響較大，此方法獲得的卵母細胞成本低，但由于淘汰的牛大多無系譜，難以做到良種化。

2.1.2 應用牛活體采卵技術采集卵丘卵母細胞

牛活體采卵技術是繼牛體外受精、胚胎移植（ET）技術之后研究并推出的又一項胚胎工程技術。牛的活體采卵技術于90年代后期開始研究，2001年，活體采卵、體外受精的牛胚胎移植后成功獲得犢牛出生。此項新技術與IVF及ET技術的配套綜合利用，將更充分地挖掘優(yōu)良母牛的遺傳潛力，縮短牛的世代間隔，擴大遺傳背景清楚、價格低廉的胚胎來源，從而加速養(yǎng)牛業(yè)的遺傳改良。同時，也可為牛的基因工程研究提供大量的試驗材料，以促進動物基因工程研究迅速發(fā)展。

2.2 活體采卵的方法

活體采卵的方法主要有盲采法、內窺鏡法和超聲波法。

盲采法完全依賴操作者的經驗進行，采集結果不穩(wěn)定，回收率低，且對卵巢和陰道組織損傷比較大，延長了采卵間隔，降低了采卵頻率，因此限制了該技術的應用。

內窺鏡法可直觀、準確地對卵泡進行穿刺，對卵巢損傷很小，但對陰道穹隆損傷比較大，且設備復雜，操作繁瑣。

超聲波法借助B超采集卵母細胞，是最主要的活體卵方法之一。

3 牛卵丘卵母細胞體外成熟培養(yǎng)

牛卵丘卵母細胞的體外成熟首次由某位外國研究者完成， 但這僅限于核的成熟。牛卵丘卵母細胞體外成熟的胚胎發(fā)育潛能直到1978 年才通過體內受精獲得犢牛證實。1986年，有關專家報道了牛卵母細胞經體外成熟及體外受精獲得的試管犢牛，進一步確證了體外成熟牛卵母細胞的可行性。

3.1 成熟培養(yǎng)液

目前，用于牛卵丘卵母細胞體外成熟的基礎培養(yǎng)液多為TCM199，也有的使用Ham's F-10， MEM， TALP等培養(yǎng)液。

3.2 培養(yǎng)液中的添加物

3.2.1 血清

血清中含有蛋白質、維生素、脂肪、激素、氨基酸等營養(yǎng)物質和多肽類因子，是卵丘卵母細胞體外成熟與受精所必需的物質，能有效提高牛卵丘卵母細胞的體外成熟率。隨著研究的深入，人們了解到血清除了可以提供卵巢上卵泡體外生長所必需的營養(yǎng)物質以外，也存在抑制卵泡生長的因素。因此，近年來研究用牛血清白蛋白或白蛋白來代替血清添加到基礎培養(yǎng)液中，起到很好的培養(yǎng)效果。

3.2.2 激素

目前，絕大多數(shù)研究者在牛卵丘卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)中添加促性腺激素或類固醇激素或兩者的混合物，結果都對卵母細胞成熟起到了促進作用。培養(yǎng)液中添加激素能夠刺激腔前卵泡的生長及腔的形成，并且抑制顆粒細胞的凋亡，而在無激素的培養(yǎng)液中卵母細胞成熟率顯著降低，且退化量大大增加。

3.2.3 生長因子

基礎培養(yǎng)基中添加各種生長因子和細胞因子，如胰島素、表皮生長因子 、胰島素生長因子 、白血病抑制因子 、轉化生長因子 等，對卵母細胞的生長、成熟可起到重要的調節(jié)作用。生產因子是卵母細胞成熟的誘導劑，能促進牛卵丘卵母細胞的體外成熟。

3.2.4 卵泡液

卵泡液能夠提高成熟卵母細胞質的質量，同時，控制卵泡液在培養(yǎng)液中的添加濃度，可以消除其對核成熟的抑制作用。有研究表明，卵泡液對核成熟的抑制作用與所采卵泡的大小有關。來自小卵泡（ 小于3毫米） 和中卵泡（3～8毫米） 的卵泡液抑制卵母細胞核成熟，大卵泡液（大于8毫米） 對核成熟沒有抑制作用。

3.2.5 卵丘細胞

卵丘細胞能夠增加卵母細胞內谷胱甘肽（ GSH）含量，GSH具有促進精子穿卵、雄原核形成及提高組蛋白H1活性等功能。在卵丘細胞與卵母細胞之間存在間隙連接，一些小分子物質如離子、核酸、氨基酸等可在兩者之間交換，進而促進卵母細胞成熟，卵丘細胞能促進卵母細胞體外減數(shù)分裂的恢復，并且對發(fā)生GVBD后至排出PB1也起著重要作用。

3.2.6 鈣離子

細胞內Ca2+可以使無活性的促進因子，處于激活狀態(tài)，進而促進卵母細胞的成熟分裂。

3.3 培養(yǎng)條件

3.3.1 氣相條件

體外培養(yǎng)一般采用含5%CO2的空氣，或5%CO2、5%O2、90%N2的氣體。培養(yǎng)系統(tǒng)內CO2不僅可以平衡培養(yǎng)基，而且還有助于細胞代謝中的丙酮酸轉換成草酰乙酸，有利于細胞成熟。

3.3.2 溫度條件

不同的溫度對卵母細胞體外成熟的影響很大，過高或過低的溫度均不利于卵母細胞的體外成熟。牛卵母細胞一般采用39℃進行體外培養(yǎng)。

3.3.3 濕度

對于濕度的調節(jié)，一般需在CO2 培養(yǎng)箱內放置調濕盤，以維持99%～100%的相對濕度，防止因培養(yǎng)液蒸發(fā)改變培養(yǎng)基成分的濃度，影響pH值和滲透壓。

4 牛卵丘卵母細胞體外成熟的判定

牛卵丘卵母細胞的成熟是涉及細胞核、細胞質、膜、卵丘細胞和透明帶等成熟的復雜生物學過程。在形態(tài)上表現(xiàn)為紡錘體形成，核仁致密化，染色質高度濃縮形成染色體，第一極體釋放，細胞器重組，以及卵丘細胞擴展、膨脹、液化和透明帶軟化等。近年來研究者借助光鏡和電鏡逐漸揭示出這一生理生化過程的形態(tài)結構變化。由于僅有核成熟和卵丘細胞成熟能在光鏡下進行判定，而對卵母細胞的綜合成熟過程很難做一整體的具有生理學意義的評價，因而現(xiàn)在主要是以卵丘細胞擴散，并釋放出第一極體作為卵母細胞體外培養(yǎng)成熟的判定標準。

5 存在問題與展望

經過人們大量研究與探討，牛卵丘卵母細胞的體外成熟技術逐漸被掌握，并得到了不斷提高，同時也存在諸多問題，如卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育阻滯，體外成熟卵母細胞的受精率較低，卵母細胞的成熟調控機理還不完全清楚等，但是，相信隨著研究的不斷深入，存在的問題會逐步被解決，同時，隨著牛卵母細胞體外成熟技術的不斷發(fā)展和完善，其必將推動牛體外受精技術的深入發(fā)展，并且，進一步促進核移植、外源基因導入和胚胎干細胞的研究，為促使牛胚胎操作技術的深入和牛體外受精胚胎商業(yè)化的普及，提供更有利研究和應用手段。