奶牛猝死癥的流行及其病原菌的分離鑒定

周天德

1 流行病學

猝死癥呈地區性散發，主要侵襲膘情較好的幼齡家畜。近年來，該病的發生出現了新特點，就是大齡家畜的發病和死亡率有增加的趨勢。本病冬、春季節發病較多，該病的臨床特點為病程短，不見任何癥狀，突然發病，從發病到死亡2小時左右，死前無明顯體溫變化，在上槽時才表現出采食量下降，精神沉郁，全身肌肉震顫，行走不穩，結膜發紺，呼吸急促，脈快而弱，流涎，隨后倒地，四肢劃動，迅速死亡。奶牛死亡后腹部迅速膨脹，口腔流出紅色泡沫樣液體，舌脫出于口外，肛門外翻，呈角弓反張狀態。

2 剖檢變化

死亡牛尸體外觀營養狀況良好，天然孔無異常，腹脹。剖檢以全身實質器官和小腸出血為特征，心肌質地變軟，心房及心室外膜有出血斑點；血液暗紅；頜下、肩前、腸系膜淋巴結水腫，切面有斑點狀出血；肺氣腫，有出血癥狀；肝臟呈紫黑色，表面有出血斑點；膽囊、膀胱黏膜充血，有少量出血點；脾臟無明顯變化；瘤胃、網胃、瓣胃黏膜有散在的針尖大的出血點，有的形成條狀出血斑；皺胃充血、出血；小腸漿膜充血發紅，黏膜呈現斑塊狀出血或彌漫性出血；腸內容物為暗紅色粘稠液體。

3 材料與方法

病料：猝死牛的小腸內容物、肝等；培養基：血液瓊脂培養基、肉肝湯培養基；試劑：革蘭氏染液、生化試劑盒、 DNA聚合酶；儀器：PCR儀、離心機、電泳儀。

細菌分離培養：無菌采取猝死牛小腸內容物、肝，分離病原菌，接種于血液和肉湯培養基中，分別進行厭氧和需氧培養，37℃培養培養24～48小時后，觀察生長情況，挑取單個菌落進行純培養。

涂片染色鏡檢：挑取少量細菌做涂片，經革蘭氏染色后油鏡下觀察細菌形態。

生化試驗：將經過分離純化的病原菌分別接種于明膠、硝酸鹽、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、過氧化氫酶、甘露醇、淀粉、凝固血清和牛乳中，37℃培養24～48小時，觀察結果。

應用PCR技術檢測病原菌：染色體DNA的提取。將細菌在胰胨酵母精葡萄糖瓊脂（TYG）培養基中37℃厭氧培養過夜，離心后，菌細胞重懸于含溶菌酶（2克/升）的TE中，37℃孵育1小時，然后加入二烷基硫酸鈉（SDS）（終濃度為1%）、乙二胺四乙酸（EDTA）（終濃度50毫摩爾/升）和蛋白酶K（終濃度為150摩克/升），58℃水浴4小時，用等體積的飽和酚重復抽提3次，吸取上層水相，加1/5體積的乙酸銨（10摩爾/升）和2倍體積的預冷無水乙醇，充分混勻后置室溫沉淀10分鐘，用玻棒挑取線團狀的染色體DNA沉淀至另一微量離心管中，加TE溶解DNA，4℃保存。

4 結果

細菌分離培養結果：病死牛小腸內容物、肝等病料在血液瓊脂平板分離培養中未見細菌生長。經厭氧培養的血液瓊脂平皿上生長出圓形、光滑、直徑2～4毫米、邊緣不整的灰黃色菌落，周圍有明顯的溶血環。厭氧肉肝湯中均勻渾濁并產生大量氣體。

鏡檢結果：油鏡下可見短粗的革蘭氏陽性桿菌， 兩端鈍圓，單個或成雙排列，具有明顯的莢膜，無鞭毛，少數形成芽孢。初步懷疑為產氣莢膜梭菌。

生化試驗結果：分離菌能液化明膠；可還原硝酸鹽；可分解葡萄糖、乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖，產酸產氣；過氧化氫酶試驗陰性；不水解甘露醇；淀粉水解試驗陰性；不液化凝固血清；牛乳試驗呈暴烈發酵。

PCR產物電泳鑒定結果：經過30個循環后，擴增出了目的基因片段，從PCR產物的電泳結果圖中可以看出，擴增出的片段長度與預計的長度相符，為420bp。

結合臨床癥狀及剖檢變化，綜合判斷認為，奶牛所發病為產氣莢膜梭菌所致的奶牛猝死癥。

5 討論

根據流行病學調查、臨床癥狀、剖檢變化以及實驗室檢驗，診斷為由產氣莢膜梭菌引起的牛猝死癥。

由于魏氏梭菌和腐敗梭菌均可引起牛的猝死，在診斷時要注意2種細菌及其引起疾病的鑒別診斷要點。猝死癥的發生可能與其他致病菌，如巴氏桿菌、鏈球菌等引起的混合感染有關。

從牛的猝死癥防治來看，全面注射牛猝死癥多價濃縮滅活菌苗的預防效果比較理想。堅持每年春、秋、冬季節在易發病區進行免疫接種，同時還應加強對養殖戶的宣傳教育，加強飼養管理。