牛結(jié)核分枝桿菌γ—干擾素在牛結(jié)核病檢測中的優(yōu)勢

孫濤

牛結(jié)核病是由牛結(jié)核枝桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病。近年來，人結(jié)核病陽性檢出率逐年上升，世界衛(wèi)生組織在1993年4月宣布“全球結(jié)核病緊急狀態(tài)”，1998年又重申“遏制結(jié)核病的行動(dòng)刻不容緩”，并將每年3月24日定為“世界防治結(jié)核病日”。根報(bào)道，約有10.6%的人結(jié)核是由牛分枝桿菌引起的，牛結(jié)核病中的7%是由人結(jié)核桿菌引起。WHO同時(shí)指出，在那些還存在牛結(jié)核病的國家中，人類始終受到牛結(jié)核病的威脅，除非著手將其消滅，否則人類結(jié)核病的防治是不會成功的。因此，控制牛結(jié)核病的是關(guān)系到控制人類結(jié)核病能否成功的重要因素。

1 流行特點(diǎn)

牛結(jié)核分枝桿菌可以感染不同種屬的溫血?jiǎng)游铮踔涟ㄒ恍┣蓊悾渲信Ｊ羌倚笾凶钜赘械模貏e是奶牛。該病主要通過呼吸道和消化道傳播，也可通過交配傳播。結(jié)核病牛可通過痰液、奶、糞便等向外排出結(jié)核桿菌污染環(huán)境，吸入被污染的飛沫是牛結(jié)核病傳染的最主要方式，且少量牛分枝桿菌即可引起感染。采食有傳染的粘液、糞便、尿液甚至牛奶都可引起感染。人類多因牛結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌感染而致病，其感染途徑主要是食入未經(jīng)檢疫的畜產(chǎn)品，尤其是飲用未經(jīng)巴氏消毒或煮沸的患有結(jié)核牛的奶而經(jīng)消化道感染，犢牛感染牛結(jié)核分枝桿菌者最多。另外，經(jīng)常與患結(jié)核病牛接觸的人員，可由于病畜的咳嗽而經(jīng)呼吸道感染結(jié)核病。牛結(jié)核病不僅古老，而且分布很廣，世界各地都有發(fā)生。美國是世界上第1個(gè)消滅牛結(jié)核病的國家，美國早在1957年就宣布為無結(jié)核病牛群，但由于其他動(dòng)物感染結(jié)核桿菌，特別是野生動(dòng)物和觀賞動(dòng)物的結(jié)核病以及人類結(jié)核病的存在，有感染牛的可能性，所以美國的牛群仍在不斷地接受檢疫并被處于高度戒備之中。在廣大的第三世界國家仍嚴(yán)重地流行，感染率在5%～10%不等，高者可達(dá)20%，嚴(yán)重影響著人類的健康和養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。

近年來，我國奶牛養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，牛飼養(yǎng)量迅速增長，飼養(yǎng)模式呈現(xiàn)多元化，牛結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)隨之增加，控制和消滅牛結(jié)核病已經(jīng)成為主要目標(biāo)之一。控制牛結(jié)核病傳播和蔓延的主要措施是對牛群實(shí)施檢疫凈化，及時(shí)檢出和撲殺病牛，最終建立無結(jié)核病牛群。我國國務(wù)院發(fā)布了《關(guān)于促進(jìn)奶牛持續(xù)健康發(fā)展的意見》，強(qiáng)調(diào)完善奶牛重大疫病防治和撲殺政策，將患結(jié)核病而強(qiáng)制撲殺的奶牛，列入畜禽疫病撲殺補(bǔ)貼范圍。因此，牛結(jié)核病的最終凈化必須依賴快速、敏感、特異的診斷方法。

2 檢測方法

牛結(jié)核檢測的方法主要有細(xì)菌學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測、分子生物學(xué)診斷方法。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測方法主要有抗酸染色法和細(xì)菌分離培養(yǎng)法，而抗酸染色后的鏡檢靈敏度很低，采樣不合格的標(biāo)本陽性率更低，極易出現(xiàn)漏診，并無法區(qū)分耐藥結(jié)核分枝桿菌；由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢分離率低，而且需要進(jìn)行屠宰采樣，固不適用于活畜檢疫。免疫學(xué)檢測主要有結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)、比較結(jié)核菌素試驗(yàn)、血清學(xué)診斷、IFN-γ試驗(yàn)。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的牛結(jié)核病的檢測診斷方法仍是結(jié)核菌素（PPD）變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。由于遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的滯后性，此方法不能在一段時(shí)間（30天）內(nèi)重復(fù)進(jìn)行，需要長時(shí)間才能出結(jié)果，操作繁瑣，對奶牛的刺激較大，易造成產(chǎn)奶量下降。此外，由于提純結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)個(gè)體差異較大，注射劑量和結(jié)核菌素批號對牛個(gè)體反應(yīng)均有差異，會呈現(xiàn)不同的皮膚反應(yīng)，其結(jié)果以皮膚厚度的增加數(shù)為準(zhǔn)，易造成人為誤差。IFN-γ試驗(yàn)是快速診斷牛結(jié)核病的檢測方法，即在體外用禽型和牛型PPD刺激牛血，檢測釋放在牛血中的IFN-γ水平，顯著提高了檢測牛結(jié)核病的敏感性和特異性，而且由于減少了操作盒解釋上的主觀性，使結(jié)果更為客觀、可靠。1991年澳大利亞健康委員會將該方法確定為檢測牛結(jié)核病的正式方法。由于全血IFN-γ水平對結(jié)核分枝桿菌感染的檢測具有高度的敏感性和特異性，該技術(shù)為結(jié)核病的早期診斷提供了新的方法，目前OIE已經(jīng)將γ-干擾素試驗(yàn)列為國際貿(mào)易結(jié)核病檢測指定使用的替代方法，而且有商品化的試劑盒供應(yīng)，并獲準(zhǔn)用于歐盟、美國、新西蘭、澳大利亞等國家的結(jié)核病控制計(jì)劃。

3 試驗(yàn)原理

牛結(jié)核分枝桿菌皮內(nèi)結(jié)核菌素試驗(yàn)的原理是機(jī)體受到結(jié)核桿菌刺激時(shí)，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞，進(jìn)而增殖分化為致敏淋巴細(xì)胞，使機(jī)體致敏。如再次接觸結(jié)核桿菌時(shí)，致敏淋巴細(xì)胞即釋放出各種淋巴因子，發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，出現(xiàn)以單核細(xì)胞浸潤，以及由于巨噬細(xì)胞釋出深酶體酶和淋巴細(xì)胞釋出淋巴毒素所引起的組織壞死為特征的病理現(xiàn)象。皮內(nèi)注射提純結(jié)核菌素于健康動(dòng)物，不出現(xiàn)顯著的局部炎癥反應(yīng)。如果將其注入曾感染結(jié)核病的動(dòng)物，便發(fā)生遲發(fā)型超敏感性應(yīng)答，注射幾小時(shí)后注射局部出現(xiàn)紅斑、水腫及腫脹硬固等炎性反應(yīng)。注射27～72小時(shí)反應(yīng)程度最強(qiáng)，以后逐漸消退。

與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)相比IFN-γ試驗(yàn)是使用兩種單抗的夾心ELISA，提高了試驗(yàn)的特異性，克服了結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)容易出現(xiàn)假陽性的不足；皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)一般需要72小時(shí)之后才能觀察結(jié)果，比較費(fèi)時(shí)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，而該試驗(yàn)只需要保定1次動(dòng)物，省時(shí)省力；皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果判定人為因素影響較大，而該試驗(yàn)有商品化試劑盒提供，容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、比較科學(xué)和客觀。IFN-γ試驗(yàn)具有檢測早期感染的能力，平行進(jìn)行2種試驗(yàn)?zāi)軌驒z測出更多數(shù)量的感染動(dòng)物。基于上述種種優(yōu)勢，IFN-γ試驗(yàn)現(xiàn)在已在很多國家的結(jié)核病控制計(jì)劃中用作繁殖試驗(yàn)來增強(qiáng)特異性，用作平行試驗(yàn)來增強(qiáng)敏感性。

結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)被OIE列為國際貿(mào)易指定使用的試驗(yàn)，也是我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測方法。鑒于該方法也有其局限性，單靠結(jié)核菌素試驗(yàn)結(jié)果不可能從畜群中完全根除結(jié)核病。IFN-γ試驗(yàn)是OIE規(guī)定的國際貿(mào)易指定使用的替代試驗(yàn)，可以作為普查牛結(jié)核病的平行試驗(yàn)，以最大限度地檢出被感染動(dòng)物，也可作為牛結(jié)核病普查的繁殖試驗(yàn)對皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，對今后牛結(jié)核病檢疫工作具有巨大的推動(dòng)意義。