缺氧缺血性腦損傷的分子生物學研究進展

喬振虎　樊艷萍

【摘要】 缺氧缺血性腦損傷是由心臟驟停引起的較為嚴重的后果，損傷可由單純缺氧或組織中毒導致，損傷的程度則取決于缺氧的時間。動物研究表明，腦缺血后腦葡萄糖、糖原、三磷酸腺苷（ATP）和磷酸肌酸的濃度立即下降并在10-12分鐘內迅速消耗殆盡，同時細胞內外離子濃度和膜電位變化及自由基和一氧化氮產生會在數分鐘內造成不可逆的神經元和腦損傷。本文對缺血缺氧性腦損傷的分子生物學損傷機理及治療研究進展進行梳理。

【關鍵詞】缺血缺氧性腦損傷；分子生物學；神經細胞死亡

【中圖分類號】R562.21 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0099-02

1.缺氧缺血后組織的生化變化

血液循環停止后所帶來的組織損傷是多方面的。缺氧去極化是腦缺血的早期變化之一，也是機體缺氧缺血后的主要表現之一，導致細胞內外的電解質成分改變，同時ATP下降[1]。腦缺血后1-3分鐘內，局部缺血組織的兩個神經纖維和細胞體區域之間會出現一個大的負直流偏移，由于細胞功能受損造成細胞外Na+，氯化物和Ca2+降低，鉀滲透到細胞外間隙。缺氧去極化和Ca2+向細胞內的流入時造成的細胞外Ca2+、Na+濃度的急劇降低會造成細胞中Ca2+的濃度大幅增加。研究結果顯示，Ca2+向細胞內滲透的過程可能由NMDA受體所控制，使細胞內鈣激活鈣依賴過程增加，如鈣蛋白酶系統，該系統直接參與了細胞骨架、膜結構、信號轉導途徑和細胞凋亡的重塑[2]。鈣蛋白酶抑制劑可有效減少細胞死亡指示鈣蛋白酶在腦缺血損傷中發揮了重要作用[3]。鈉引發的損傷則與胞漿Ca2+的增加、ATP的減少和谷氨酸釋放綜合引起的。而運用藥物抑制Na+流通和抑制細胞內Na+濃度是防止腦缺血的有效措施。腦缺氧缺血后一到兩分鐘內，高能磷酸鹽（如ATP）即下降到其最低值，乳酸和氫離子（H+）釋放造成細胞內PH值下降形成酸中毒，當PH值在6.1-6.5之間時，神經元僅可存活約10-12 min，長時間的酸中毒，會使細胞功能受損和水腫情況進一步加劇。此外，高血糖增加乳酸量分泌量從而使酸中毒狀況進一步惡化，因此慢性高血糖可增加缺血性損傷程度，增加死亡率[4]。此外，腦缺血時，具有毒性和興奮性的神經遞質—谷氨酸釋放，同時其他一些具破壞性的酶如脂肪酶，蛋白酶和核酸酶被激活，對神經元組織造成破壞。自由基含量也會在腦缺血后的初期增加[5]。另外，腦缺血后，一氧化氮產生，過氧亞硝酸鹽和一氧化氮毒性的主要介體也會相應產生[6]，Panahian等用去除了神經型一氧化氮合酶的小鼠進行動物實驗發現清除一氧化氮后小鼠椎體細胞的細胞損失率由85%降為了32%，指示一氧化氮與細胞凋亡具有密切的關系。因此腦缺血后一氧化氮的增加可能加快了細胞死亡從而導致腦損傷。對缺氧缺血后組織的生化變化及導致的腦損傷機制進行梳理如表1所示。

缺血缺氧后，由于細胞內外介質條件發生改變從而造成了細胞功能的變化，其主要由線粒體受損、細胞骨架破壞和谷氨酸受體的激活所引起。細胞內Ca2+增大的早期，線粒體會發生損傷，可以明顯的觀察到線粒體的瞬間腫脹，并伴隨有解聚核糖體和高爾基復合體異常現象[7]。線粒體功能受損可引起ATP的降低、自由基的過量產生，降低了細胞對鈣負荷的緩沖作用，細胞骨架遭到破壞而無法保持正常的細胞結構從而造成細胞死亡。這也是導致細胞凋亡的重要因素之一。缺血缺氧會抑制蛋白質的合成，該過程可持續1-24 h的周期，具體時間取決于缺血缺氧類型和再灌注的時間，但是在蛋白質的合成完全恢復后的12-48 h，盡管多數細胞可以恢復蛋白質合成從而維持正常功能，但是已經死亡的細胞則無法恢復正常功能。細胞內Ca2+的增加量以及NMDA受體的激活則是抑制神經元蛋白合成的主要因素[8]。在腦部缺血缺氧后的30 min內，谷氨酸受體的興奮性活化在熱休克蛋白的表達和引發大量立早基因的快速轉錄方面發揮了主要作用[9]。在輕微缺血缺氧情況下，立早基因可在受損的神經元和非神經元細胞中發現，而嚴重缺血缺氧情況下，甚至會在非受損神經元和細胞中發現立早基因，說明立早基因在神經元細胞的存活和死亡選擇中發揮了一定的作用。熱休克蛋白在保護受損神經元過程中發揮了重要作用從而作為指示神經元能否存活的一個敏感指標，在缺血缺氧后細胞損害還未達到一定程度就可通過ATP下降信號的激活而快速有效的表達，這也反映了細胞自我保護機制的表達。

3. 缺氧缺血后神經細胞死亡

腦缺血缺氧的時間如果超過腦復蘇的時間，則會導致不同程度的神經元細胞死亡。研究結果顯示，腦缺血后神經細胞死亡與興奮性氨基酸的神經毒作用、一氧化氮的神經毒作用及鈣超載有密切關系。

前文中已經闡述興奮性谷氨酸在腦缺血后的釋放是導致神經元組織遭到破壞的重要原因。興奮性氨基酸的受體有多種，而NMDA受體是其最為主要的受體之一，NMDA受體激活后可使Na+和Ca2+進入細胞。在缺血缺氧情況下，發揮阻斷NMDA受體作用的鎂離子作用因能量缺乏受到抑制從而失去對NMDA受體的阻斷作用，從而導致Ca2+和Na+在細胞內富集造成對細胞的損害。研究結果顯示，在缺乏谷氨酸受體或受體阻斷的神經元在缺血缺氧條件下仍可以存活數小時，但缺血缺氧時谷氨酸受體得到激活則很快導致神經元細胞的死亡[10]。缺血缺氧造成興奮性谷氨酸的釋放或濃度增大是由多種因素造成的。首先，缺血缺氧時，ATP含量顯著降低，去極化作用時細胞內Na+和Ca2+濃度增大，同時也會引起谷氨酸的釋放；其次，細胞內Na+濃度的增大會使細胞膜陰離子通道得到激活從而引起谷氨酸的釋放；最后，細胞內ATP的減少導致細胞攝取谷氨酸的功能受到影響從而造成細胞間隙中的谷氨酸含量增大。.

一氧化氮可由一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase， NOS）和L-精氨酸催化產生，NOS廣泛存在于中樞神經系統的細胞中，在腦缺血缺氧情況下，NOS激活并產生一氧化氮，其濃度可在缺血缺氧后數分鐘內即增加。一氧化氮在神經系統的發育特別是神經元突觸的重塑和神經網絡的建立中發揮重要作用。但是在腦缺血缺氧時具有保護和損傷的雙重作用，具體則取決于一氧化氮的濃度、缺血缺氧的持續時間和遇到的靶分子[11]。在缺血缺氧的初期（一般認為數分鐘或幾小時內），一氧化氮的合成具有保護作用，但長時間的缺血缺氧后則會產生損傷作用[12]，其損傷主要因為與氧化物之間發生氧化作用產生氧化氮、導致細胞鐵離子丟失，加速磷脂過氧化從而破壞線粒體呼吸鏈、抑制ATP合成酶的合成作用，從而造成細胞中毒損傷。

Ca2+對多種細胞功能的正常發揮起到了重要作用，細胞內Ca2+濃度的變化是維持細胞生理功能所必不可少的過程。正常情況下，細胞內Ca2+濃度僅為細胞外的萬分之一，缺血缺氧時興奮性谷氨酸的釋放及膜電位的變化使依賴性鈣通道和NMDA受體通道激活，大量細胞外Ca2+進入細胞內造成細胞內Ca2+濃度增大數十倍。細胞內Ca2+濃度的增大會通過產生活性自由基和一氧化氮對神經細胞產生損傷。同時還可以激活多種蛋白酶造成細胞骨架的破壞最終造成神經細胞功能紊亂進而死亡。Ca2+濃度的增大還可以造成線粒體膜通透性發生改變，產生線粒體通透性轉換通道[13]，進而引起線粒體呼吸鏈功能受損，ATP合成抑制對神經細胞造成損害。

4. 缺血缺氧性腦損傷分子治療技術

缺血缺氧后的腦損傷由以上多種分子機制造成，因而通過分子技術促進神經保護和減少神經損害成為治療缺血缺氧性腦損傷的重要治療方法。神經營養因子是目前最為主要的促進神經保護從而治療缺血缺氧性腦損傷的分子技術，其主要由神經生長因子（Nerve growth factor， NGF）、睫狀神經營養因子（Ciliary neurotrophic factor， CNTF）和堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor， bFGF）。

NGF在神經細胞的發育、成熟和存活過程中發揮重要作用。體外實驗已經證實，得到NGF供應的神經細胞得到存活而沒有得到NGF的神經細胞則會死亡。在缺血缺氧時NGF表達激活，會保護神經細胞不受損害，抑制神經細胞凋亡[14]，同時還具有促進神經細胞功能恢復的作用。但是在機體中，NGF在缺氧缺血后的表達時間很短暫，難以起到有效的保護神經細胞的作用，因此臨床上采用注射自小鼠體內NGF的方法治療缺血缺氧性腦損傷。CNTF主要起對中樞及周圍運動神經元的營養作用，對神經元的發育和分化具有重要影響。研究表明，神經損傷后CNTF的表達顯著增加，說明CNTF在神經元的修復和再生過程中發揮作用。動物實驗證實腦缺血缺氧后側皮質和海馬區的CNTF表達明顯增強[15]，而向腦缺血的大鼠側腦室注射CNTF可明顯的改善由缺血性腦損傷帶來的認知障礙，注射一側丘腦的神經元退行性改變也得到一定的改善[16]，說明CNTF在缺血缺氧后神經損傷的修復中起了一定的作用。bFGF是一種有效的神經營養因子，能刺激神經膠質細胞的非有絲分裂活性，促進多種神經保護酶和蛋白的合成及釋放，在激活神經活性、保護神經元、促進神經突起增生和神經干細胞增殖方面具有強力作用，能抵御前述幾乎全部因子對神經元的損傷，如鈣超載、一氧化氮毒性、自由基和興奮性谷氨酸等。腦損傷后，bFGF表達加強，當bFGF用于損傷的大腦時，能促使海馬神經元存活，而無bFGF時海馬神經死亡。同時與NGF相比，bFGF刺激SC增殖，促進毛細血管形成改善損傷神經及周圍組織的血供方面的優勢已經被證實，盡管bFGF在保護神經元方面的機制還在進一步研究之中，但是bFGF已經表現出了在治療神經損傷方面的潛力。

參考文獻

[1] Xie Y， Zacharias E， Hoff P， et al. Ion channel involvement in anoxic depolarization induced by cardiac arrest in rat brain[J]. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism， 1995， 15（4）： 587-594.

[2]Goll D E， Thompson V F， Li H， et al. The calpain system[J]. Physiological reviews， 2003， 83（3）： 731-801.

[3]Lee K S， Frank S， Vanderklish P， et al. Inhibition of proteolysis protects hippocampal neurons from ischemia[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1991， 88（16）： 7233-7237.

[4]Hoxworth J M， Xu K， Zhou Y， et al. Cerebral metabolic profile， selective neuron loss， and survival of acute and chronic hyperglycemic rats following cardiac arrest and resuscitation[J]. Brain research， 1999， 821（2）： 467-479.

[5]Piantadosi C A， Zhang J. Mitochondrial generation of reactive oxygen species after brain ischemia in the rat[J]. Stroke， 1996， 27（2）： 327-332.

[6]Endoh M， Maiese K， Wagner J. Expression of the inducible form of nitric oxide synthase by reactive astrocytes after transient global ischemia[J]. Brain research， 1994， 651（1）： 92-100.

[7]Petito C K， Feldmann E， Pulsinelli W A， et al. Delayed hippocampal damage in humans following cardiorespiratory arrest[J]. Neurology， 1987， 37（8）： 1281-1281.

[8]Raley-Susman K M， Lipton P. In vitro ischemia and protein synthesis in the rat hippocampal slice： the role of calcium and NMDA receptor activation[J]. Brain research， 1990， 515（1）： 27-38.

[9]Kiessling M， Stumm G， Xie Y， et al. Differential transcription and translation of immediate early genes in the gerbil hippocampus after transient global ischemia[J]. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism， 1993， 13（6）： 914-924.

[10]Rosenberg P A， Aizenman E. Hundred-fold increase in neuronal vulnerability to glutamate toxicity in astrocyte-poor cultures of rat cerebral cortex[J]. Neuroscience letters， 1989， 103（2）： 162-168.

[11]Mayer B， Hemmens B. Biosynthesis and action of nitric oxide in mammalian cells[J]. Trends in biochemical sciences， 1997， 22（12）： 477-481.

[12]Nagayama M， Zhang F， Iadecola C. Delayed treatment with aminoguanidine decreases focal cerebral ischemic damage and enhances neurologic recovery in rats[J]. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism， 1998， 18（10）： 1107-1113.

[13] Bernardi P， Petronilli V. The permeability transition pore as a mitochondrial calcium release channel： a critical appraisal[J]. Journal of bioenergetics and biomembranes， 1996， 28（2）： 131-138.

[14] Cattaneo E， McKay R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor[J]. Nature， 1990， 347（6295）： 762-765.

[15] Hu J， Saito T， Abe K， et al. Increase of ciliary neurotrophic factor （CNTF） in the ischemic rat brain as determined by a sensitive enzyme-linked immunoassay[J]. Neurological research， 1997， 19（6）： 593-598.

[16]Kunion Y， Sakaki S， Watanabe H， et al. Ciliary neurotrophic factor attenuates spatial cognition impairment， cortical infarction and thalamic degeneration in spontaneously hypertensive rats with focal cerebral ischemia[J]. Neuroscience letters， 1996， 206（2）： 141-144.