益母草顆粒微生物限度檢查方法驗證

馬淑艷

【摘要】按照《中國藥典》2005年版附錄對微生物限度檢查的要求，采用常規法對益母草顆粒進行微生物限度檢查方法的驗證，確認所采用的方法適合于益母草顆粒的微生物限度檢查，即確認益母草在該檢驗量，該檢驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不計，以保證檢驗結果準確，可靠及檢驗方法的完整性。結果表明，益母草顆粒無抑菌作用，常規法對無抑菌作用的益母草顆粒進行微生物限度檢查的結果可靠，準確。

【關鍵詞】益母草顆粒；微生物限度檢查；方法驗證

【中圖分類號】R917 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0168-01

藥品微生物限度檢查是控制藥品微生物污染的重要手段，包括細菌，霉菌及酵母菌計數及控制菌檢查，是藥品安全性的重要指標之一。隨著藥品劑型的日益發展和藥品標準的不斷提高，及時有效地進行藥品微生物限度檢查是擺在藥檢工作人員面前的重大課題。藥品微生物限度檢查方法為《中國藥典》1995年版首次收載，并在《中國藥典》2005年版增訂了方法驗證實驗，為藥品微生物限度檢查結果的可靠性提供了保障。

在做微生物限度檢查時，經常發現有抑菌作用，那么對有抑菌作用的藥物按常規法做微生物限度經常藥品，以確認所 采用的方法適合該樣品的微生物限度檢查。本文結合執行《這個藥典》2005年版及《美國藥典》28版，《英國藥典》2002版有關微生物限度檢查法，按照中國藥品檢驗標準操作規范及有關文獻，以益母草顆粒為例。益母草顆粒為治療月經量少，產后腹痛的藥物，具有活血調經的功效。藥品中含有益母草一味中藥材成分，固益母草沒有抑菌作用，可采用常規法進行實驗研究，最終確定采用常規法進行細菌數，霉菌數及酵母菌數的測定，采用常規法進行控制菌的檢查，經對所采用的方法進行驗證，符合2005年版《這個藥典》二部附錄ⅪJ有管微生物限度檢查法有關規定，方法可行。

益母草為唇形科植物益母草的干燥全草，又名茺蔚，益母蒿，坤草，月母草，地母草等，原生于山野荒地，田埂，河灘，草地，路旁，溪邊等處，全國各地均有分布，部分地區有栽培，是常用的中藥材品種。

益母草的化學成分主要有：①生物堿，近幾年在生物堿的提取方法方面有了很大的改進，郭孝武等采用不同頻率的超聲波技術，該法工藝簡單，提取率高，有較高的開發價值。王坤等用外循環灌裝式提取工藝，提取率高并且節省能源，縮短生產周期，適用工業化生產。葛發歡等常用超臨界二氧化碳萃取技術比常規法提高10倍；②二萜，從益母草中分離出34個二萜類成分，其中Labdane型二萜類成分prehispanone是一種血小板活化因子的拮抗劑，能競爭性抑制血小板上的血小板凝聚因子（PDF）受體，從而達到抗凝血目的。近期張嫻等又從益母草中分離出2個化合物益母草酮A，β—谷甾醇，其中化合物益母草酮A為一種新的Labdane型化合物；③阿魏酸，羅毅等自益母草中提取分離出阿魏酸，并對其進行色譜鑒定，初步確定益母草種含有阿魏酸。研究者采用薄層色譜法和HPLC法鑒別不同提取溶媒制備的樣品，各樣品均從益母草中檢出阿魏酸以百分之五的碳酸鈉超聲提取最好；④揮發油，王金輝等和叢悅等近期又從益母草的干燥地上部分的水提取物中經過大孔樹脂，硅膠柱色譜，制備色譜和HPLC分離得到2個化合物，首次從該種植物中分離得到2，6-二甲基-2E，7-辛二稀-1，6-二醇和ajugoside。⑤其他，多糖：劉曉河等采用水楊酸法測定還原性單糖的含量和水解后的總糖含量，從而間接測出益母草中的多糖含量，該方法簡便，快速，準確，消除了樣品中還原性單糖對多糖含量測定的影響。微量元素：任曉偉等從細花益母草中測定到微量元素的存在，并且葉和花中的微量元素多與莖中的微量元素，與調經活血的機制是一致的；其他的還有黃酮，苷類如環烯醚萜苷類，苯丙醇苷類，強心甾苷類等。

益母草的藥理活性主要有抗血栓形成，利尿，改善淋巴系統，興奮子宮，抗誘變作用，減少心肌損害。

1. 樣品名稱及來源

名稱：益母草顆粒

批號：1508014

生產廠家：廣西靈峰藥業有限公司

處方組成：益母草，蔗糖，糊精

2. 試驗材料及儀器

儀器：35℃恒溫培養箱：303A-6型 北京北德工貿有限公司

33℃恒溫培養箱：303A-6型 北京北德工貿有限公司

25℃恒溫培養箱：303A-6型 北京北德工貿有限公司

高壓蒸汽滅菌器：LDZX-40Ⅱ型 上海申安醫療器械廠

調速多用振蕩器：HY-2 國華電器有限公司

電子天平：SL102N 上海民橋精密儀器廠

試驗菌株：

大腸埃希菌 Escherichia Coli [CMCC（B）44102]

金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus [CMCC9（B）26003]

枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis [CMCC（B）63501]

白色念珠菌 Candida albicans [CMCC（F）98001]

黑曲霉菌 Aspergillus niger [CMCC（F）98003]

對菌株的要求：驗證試驗所用的大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉菌的傳代次數均不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍買那個干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學活性。

稀釋劑：PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京奧博星生物技術有限公司），0.9%無菌氯化鈉（本所配制）

培養基（由北京奧博星生物技術有限公司，北京三藥科技開發公司提供）

營養瓊脂培養基（批號 060412），改良馬丁培養基（批號060412），改良馬丁瓊脂培養基（批號060105），營養肉湯培養基（批號060412），膽鹽乳糖培養基（批號060412），膽鹽乳糖發酵培養基（批號 060207），玫瑰紅鈉瓊脂培養基（060412）

消毒液：0.1%苯扎溴銨溶液（供洗手，擦試操作臺面用），75%乙醇溶液

3. 試驗部分

3.1菌液制備

接種大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基，35-37℃培養18-24小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml含50—100cfu的菌懸液。

接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，23-28℃培養24—48小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml含50—100cfu的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中，23-28℃培養5—7天，使大量的孢子產生，加入3—5ml的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用墊有脫脂棉的漏斗（濕熱滅菌）過濾，除去菌絲，取此菌原液0.1ml用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml含50—100cfu的孢子懸液備用。

3.2菌落計數（每種菌接種兩個平皿）

上述大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌三種菌液在試驗的同時分別取1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15—20ml溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂培養基，迅速混勻，凝固，35℃倒置培養。取黑曲霉，白色念珠菌菌液各1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15—20ml溫度不超過45℃的溶化的改良馬丁瓊脂培養基，迅速混勻，凝固，25℃倒置培養。

取供試品10g，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，制成1：10的供試液備用。

3.4菌落計數方法驗證（常規法）

㈠ 細菌，霉菌及酵母菌檢查法驗證

當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行細菌，霉菌及酵母菌計數方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌，霉菌及酵母菌數的測定，若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法應重新驗證。

①試驗組：取1：10供試液1ml，分別注入兩個無菌平皿，每個平皿加試驗菌1ml，立即注入45℃的溶化的相應培養基15—20ml，搖勻，凝固后，將平皿倒置，于規定的溫度培養至規定時間，做菌落計數。

②菌液組：取稀釋好的各菌液1ml，分別加入無菌平皿中，加入相應培養基，置規定條件培養，測定所加的試驗菌數，每株試驗菌制備二個平皿。

③供試品對照組：測定供試品本底菌數，方法同試驗組（不加菌液）。

④稀釋劑對照組：分別取稀釋劑1ml，加入含50—100cfuml的試驗菌測定其菌數。

回收率的計算公式：

稀釋劑對照組的平均菌落數

稀釋劑對照組菌回收率=───────────────×100%

菌液組的平均菌落數

試驗組的平均菌落數—供試品對照組的平均菌落數

試驗組菌回收率=──────────────────────×100%

菌液組的平均菌落數

81㈡控制菌檢查法的驗證（常規法）

當建立藥品的微生物限度檢查時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查，若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，檢查方法應重新驗證。

驗證時，依個各品種項下微生物限度標準中規定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時，應采用大腸埃希菌作為驗證菌株。

①試驗組：取1：10供試液1ml，加膽鹽乳糖培養基100ml，再加1ml陽性菌（即大腸埃希菌數，霉菌數及酵母菌數驗證）搖勻；取膽鹽乳糖發酵培養基1支，加1：10供試液1ml，再加1ml大腸埃希菌，搖勻，置30--35℃培養18—48小時。

②陰性對照組：方法同試驗組，分別加入1ml陰性菌（即金黃色葡萄球菌，濃度同細菌數，霉菌數及酵母菌計數驗證）。

4.結論

①計數法驗證：在三次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率均不低于70%，故可照該供試品制備方法和計數法，測定益母草顆粒的細菌，霉菌及酵母菌數。

②控制菌檢查法驗證：陰性對照菌未檢出陽性對照菌，試驗組檢出陽性菌，故可照此供試液制備法和控制菌檢查法進行益母草顆粒的控制菌檢查。

4. 討論

操作環節對回收率有影響，在注入1ml供試液后，隨即加入50—100cfu的菌懸液，此時未注入培養基，菌懸液暫時與高濃度供試液混合或不完全混合，若此供試品有較強的抑菌作用，則較高濃度的供試液無疑會對菌懸液中的活菌數帶來影響，因此，要盡快注入培養基，并且立即將培養基搖勻，以免菌落數過于集中不便于最后計數。

為減少實驗誤差，建議在操作過程中應遵循以下原則：為了防止二次污染和微生物繁殖或死亡，實驗前應用紫外燈照射樣品的外包裝，檢驗時，應從兩個以上最小包裝單位中抽取供試品；實驗室環境應符合2005年版《中國藥典》提出的要求，微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區域內進行，檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染；實驗用的標準菌株的保存及菌液的制備應符合藥典要求。

參考文獻

[1] 中國藥典[S].二部，2005：附錄96

[2]美國藥典[S].28版，2005：2752

[3] 英國藥典[S].2002版，2002：Apendix XVI BA315

[4] 中國藥品檢驗標準操作規范[S].2005：325

[5] 馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京：科學出版社，2000

[6] 鄭鈞康，王光寶.藥品微生物學及檢驗技術[M].北京：人民衛生出版社，1989

[7] 葛發欣，史慶龍，許精芬.超臨界二氧化碳萃取益母草總生物堿.中藥材，2001，24（6）：415

[8]HonPM，LeeCM，Shang HS，et al，Prehispanolone alabdane diterpene from Leonurus heterophyllus.phytochemistry，1991，30：354-356

[9] 張嫻，彭國平.益母草化學成分研究.天然產物研究與開發，2004，16（2）：104-106

[10] 羅毅，羅云，周本宏，益母草阿魏酸的分離和色譜鑒定.廣東藥學院學報，2004，20（5）：462-463

[11] 秦雪梅，郝旭亮，周迎春.益母草中阿魏酸的色譜鑒別.中草藥，2001，32（5）：447

[12] 王金輝，叢悅，李銑，等.益母草化學成分的分離與鑒定.中國藥物化學雜志，2002，12（3）：146-148

[13]CalisI，EesozT，TasdemirD，et al.Two phenypropaniod glycosides from leonurus glaucescens.Phytochemietry，1992，31：357-359

[14]TasdemirD，ScapozzaL，ZerbeO，et al.Iridoid glycosides of leonurus persicus.J Nat prod，1999，62：811-816

[15] 夏瑛瑛，7種中成藥微生物限度檢查法的方法驗證.中國藥業，2007，16（19）