內皮微粒在缺血再灌注損傷中作用研究進展

阮志華等

【摘要】內皮微粒（Endothelial Microparticle，EMP）是由內皮細胞釋放的微小囊泡狀顆粒。內皮損傷是缺血再灌注損傷（Ischemia Reperfusion Injury，IRI）的重要環節，EMP反映內皮損傷并通過不同機制參與IRI的發生發展。本文就EMP的生成、生物學特征和檢測以及在IRI中的作用做一概述。

【關鍵詞】內皮微粒；缺血再灌注；損傷

【中圖分類號】R722.12 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）02-0765-01

缺血再灌注損傷是指在缺血一定時期的基礎上恢復組織器官的血流供應，不僅不能減輕其缺血性損害，反而加重功能障礙和結構損傷的現象，臨床上常見于冠心病、心血管手術及移植手術等。內皮微粒是內皮細胞在激活或凋亡情況下釋放的一種由磷脂膜包被的微小囊泡狀物質，在凝血、炎癥、氧化應激及內皮損傷等方面發揮作用。內皮損傷是IRI進程中的一個重要環節，由內皮細胞釋放的EMP也在此進程中發揮作用，有研究[1-2]證實EMP參與IRI，對內皮功能有影響。有關EMP的研究越來越多，對其來源、特征及在疾病發生發展過程中所起作用已經有了一定程度的了解。

1 EMP生成與檢測

1.1 EMP的生成

血液中微粒種類根據其來源可分為血小板微粒、內皮微粒、紅細胞微粒、白細胞微粒等。Hamilton[3]于1990年利用C5b-9補體蛋白誘導內皮細胞釋放囊泡，首次檢測出一種直徑<1μm的顆粒，命名為EMP。EMP 的研究多源于體外分離或培養的細胞，體內內皮細胞生成EMP的機制仍不明確，但普遍認為與內皮細胞損傷相關，也有研究認為理化因素引起的細胞激活或凋亡可導致EMP生成。Chironi[2]認為EMP的產生與內質網鈣釋放增加有關，細胞膜由脂質雙分子層構成，內層含有磷脂酰絲氨酸（PS），當胞質內鈣離子突然增加改變了跨膜穩定狀態時，細胞骨架纖維斷裂，使得內層的PS外翻，細胞膜上囊泡形成并釋放到細胞外液中形成EMP。Leroyer[4]研究發現細胞凋亡過程中會產生EMP。一些促炎、促凋亡、及氧化性物質也可刺激EMP釋放，Combes等人最早于1999年即發現TNFα可以刺激人臍靜脈內皮細胞釋放EMP，其它如IL-1β、脂多糖、氧化應激等均有此作用；某些疾病如糖尿病、肺動脈高壓等亦可導致EMP釋放增加[5-8]。Wang[9]等人的研究發現，在某些情況下，內皮型一氧化氮合酶的解耦連也參與EMP的生成，這說明EMP與一氧化氮依賴性的內皮功能不全可能存在某種相關性。

1.2 EMP的特征與檢測

微粒的成分由其來源所決定，包括含磷脂的脂質雙分子層、膜表面蛋白、膜內容物等，內皮細胞來源的EMP主要包含有代謝相關的酶類，參與粘附和融合過程的蛋白及一些細胞骨架蛋白[10] 。對于EMP的膜內容物目前所知甚少，可能含有少量核碎片及細胞質。EMP含有內皮細胞成分，因此可以采用相關抗體作用于上述成分所表達的抗原以檢測并確定EMP來源[11]。正常內皮細胞膜脂質雙分子層的磷脂分布具有不對稱性，在活化或凋亡的細胞，這種不對稱性消失，導致脂質雙分子層外層PS增加，EMP表面PS同樣如此。PS在止血和凝血方面具有重要的意義，可與凝血因子結合，啟動凝血過程，對受損部位凝血過程起到調節作用，這也表明EMP的釋放可能會影響凝血功能，增大血栓形成風險[12]。PS能特異性的與非EMP膜蛋白annexin V結合，利用熒光素標記的annexin V與PS相結合即可檢測到EMP的存在。Annexin V的缺點是敏感性及特異性均不足，因此還可以利用EMP膜蛋白成分來對其進行檢測。EMP的表面攜帶有特異性抗原分子，不同疾病情況下EMP表面攜帶抗原表型有所不同，包括CD31、CD62E、CD144等多種分子，而有些抗原分子如CD42則不表達。EMP主要來源于內皮細胞，因而表達多種內皮細胞特異性表面蛋白，在內皮細胞激活或凋亡過程中也會出現一些新的成分。Chironi等總結了近十余年的多項研究，發現不同情況下EMP的免疫表型有所不同，在急性冠脈綜合征、嚴重高血壓、1型糖尿病、肺動脈高壓等多種疾病過程中，EMP的抗原分化群呈現不同的表型特征，例如抗原表型為CD31+/CD42-的EMP可見于嚴重高血壓患者，而抗原表型為CD31+/ CD42-/ CD62E+的EMP則可見于代謝綜合征患者[13-14]。在流式細胞儀檢測時，利用相應抗體檢測EMP的抗原表達，結合標準微球來確定EMP直徑范圍即可精確測定某種疾病狀態下的EMP含量。除此之外，還可以用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定EMP，但其應用遠不如流式細胞儀檢測法廣泛。

2 EMP與缺血再灌注損傷

缺血再灌注過程中，微循環缺血及后續的再灌注過程首先影響內皮細胞，導致內皮細胞的損傷和功能障礙，受損的內皮細胞釋放EMP，釋放的EMP不僅反映內皮損傷的程度，而且還作用于內皮細胞本身并參與炎癥反應、凝血/血栓形成等多個過程，從而參與并導致IRI。上述進程形成了一個缺血再灌注—內皮損傷—EMP釋放—加重缺血再灌注損傷的通路。

2.1 缺血再灌注與內皮損傷

IRI發生機制的研究較多，普遍認為與氧自由基增多、細胞內Ca2+超載、能量代謝障礙、內皮細胞損傷、炎癥因子釋放及凝血異常等有關。缺血再灌注過程直接作用于內皮細胞，導致內皮細胞形態改變和功能受損。缺血再灌注時產生的大量氧自由基對膜磷脂、細胞骨架、核酸有損傷作用，這可能是內皮損傷導致EMP生成的原因之一，Kim[15]的研究也證實了抑制活性氧簇（ROS）生成對減輕IRI有一定作用。Ca2+超載導致線粒體功能障礙，細胞能量供應不足，促使進氧自由基生成，生成的氧自由基又進一步加重Ca2+超載，二者形成惡性循環，加重內皮損傷。由于缺血導致內皮細胞能量供應不足，ATP減少，細胞代謝異常、水腫，進而微血管舒縮功能異常，再灌注期局部出現“無復流”現象使得損傷進一步加重[16-19]；再灌注后炎癥介質大量釋放，引起內皮細胞表面粘附分子表達，使中性粒細胞與內皮細胞粘附并釋放氧自由基及破壞性蛋白酶，損傷內皮。內皮細胞不僅構成血管屏障，還有分泌功能，釋放多種生物活性物質，調節血管舒縮狀態，內皮損傷在IRI中主要表現為抗氧化能力下降和血管活性物質的釋放異常。內皮細胞可合成釋放一氧化氮（NO）、內皮素（ET）、前列腺環素（PGI2）等物質，缺血再灌注時NO合成減少而ET、PGI2則增加，導致血管異常收縮出現無復流現象，加重組織缺血缺氧。有研究表明[20]內皮系統的抗氧化活性與對氧化活性的敏感性存在相關性，缺血再灌注時內皮細胞清除活性氧能力降低，同時對外源性活性氧產生系統的敏感性增加，導致活性氧大量產生，進而損傷細胞。

2.2 EMP參與缺血再灌注損傷

在IRI過程中，EMP由受損的內皮細胞釋放，EMP的產生不僅是IRI對內皮細胞的作用結果，同時也參與IRI進程。EMP可以反過來作用于內皮細胞本身，使其損傷進一步加重。逢利[21]通過對大鼠心肺復蘇后細胞膜微粒變化的研究，發現EMP的含量增加，認為EMP參與了腦缺血再灌注損傷的發生發展過程。Ci HB等[22]發現二尖瓣疾病患者的EMP含量增加，進而減少二尖瓣內皮細胞NO的生成，而使超氧化物陰離子（O2-）的含量增加，最終損傷內皮細胞，其損傷機制可能是通過抑制Akt/eNOS-HSP90信號通路而發揮作用。區景松等研究發現，EMP抑制熱休克蛋白90（HSP90）與內皮型一氧化氮合酶（eNOS）結合，使eNOS解偶聯而刺激內皮細胞產生O2-，產生的O2-不僅直接損傷內皮細胞，同時還參與IRI進程。EMP可以明顯抑制內皮依賴的血管舒張功能，其機制為抑制內皮細胞生成具有舒血管作用的NO，這可能也是再灌注組織發生“無復流”現象而加重損傷的原因之一，陸永光等人的研究也部分性的證實了這一點[23-25]。Chirions[26]等發現EMP含量與血液中IL-6的水平正相關，EMP可以通過其表面的CD62E結合到中性粒細胞上，使之激活，說明EMP與炎癥反應之間有一定關系，這也可能是EMP在IRI中發揮作用的途徑之一。吳志宏[27]等研究發現EMP在體外可以促進內皮細胞的凋亡，可能與EMP影響內皮細胞酶激活因子1，使其激活Caspase-3，而Caspase-3是凋亡信號傳導途徑的關鍵分子，可以促進細胞凋亡。EMP能激活NF-κB信號通路，該通路的活化參與了許多促炎細胞因子的表達，同時NF-κB還可以調控細胞間粘附分子1（ICAM-1）的表達，而ICAM-1介導的單核-巨噬細胞的粘附被認為是血管損傷后炎癥反應的重要環節，這也是EMP介導炎癥反應，參與IRI的途徑之一。膿毒癥時EMP表達組織因子（TF），TF轉移到血小板上啟動凝血過程，導致血栓形成，可繼發性的導致微循環障礙加重組織缺血缺氧。Chirinos研究認為，血栓形成除了與EMP釋放有關外，還與EMP-白細胞、血小板-白細胞結合物形成有關，說明EMP參與凝血過程，這也許是缺血后的再灌注過程中，EMP導致凝血異常，進而導致微循環障礙，加重組織損傷的機制之一。

EMP現已經被認為是一種新的診斷內皮功能不全的標志物，反映了內皮細胞的功能狀況。在IRI過程中，EMP的產生繼發于缺血及再灌注導致的內皮損傷，EMP攜帶的生物學標志物具有相應功能，參與炎癥反應、凝血/血栓形成，影響內皮依賴性血管舒張，因此可以通過上述途徑影響IRI的發生發展。對EMP的來源、特征及其在IRI中生物學活性的作用機制研究有助于進一步了解IRI的發生機制及防治，為IRI的發生機制及診斷、治療的研究提供了新的方向。

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