腦梗死大鼠CD4＋CD25＋調節性T 細胞的作用

李 楠 白宏英

鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

腦梗死是繼惡性腫瘤、心肌梗死后第三大嚴重影響人類健康的疾病。同時是致殘率最高的原因。腦梗死是當今世界成人死亡和致殘的主要原因之一，2008年調查顯示，腦梗死已成為中國人口致死的首要原因。由于急性腦梗死的溶栓時間窗限制（發病后3～6h），溶栓治療受益率極低，目前對大部分病人存在的神經功能損傷尚無確實有效的臨床治療手段。腦梗死組織周邊炎性免疫反應的輕重與梗死后神經損害程度密切相關［1］。CD4＋CD25＋調節性T 細胞是一種具有免疫調節作用的細胞，本研究擬動態觀察腦梗死后CD4＋CD25＋調節性T 細胞的表達，探討其在腦梗死后的免疫調節作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 成年雄性wistar大鼠40只（鄭州大學實驗動物中心培育），體質量200～220g，隨機分為5組，分別為大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）24h、72h、1周、2周組和假手術組，每組8只。采用線栓法制作MCAO 模型，術后24h動物清醒后，應用Zea等［4］方法進行神經功能評分。0分：無神經功能缺損癥狀；1分：不能完全伸展左前肢；2分：行走時向左側轉圈；3分：自主行走時向左側傾倒；4分：存在意識障礙。l～3分定義為模型制作成功，模型制作不成功者隨機補充。

1.2 外周血中CD4＋CD25＋調節性T 細胞的檢測 大鼠麻醉后心 臟 取 血，依 次 加CD4－FITC lμL、CD25－Percp 和Ig－Glk－Percp0.5ul（美國eBoiscience公司）到檢測管和對照管，加0.5mL破膜液（博士德生物技術有限公司），4 ℃冰箱（日本三洋電機公司）孵45 min，加2 mL 破膜液，加Foxp3－PE和IgG2ak－PE 5ul（美國eBoiscience公司），洗滌1次；加0.5 mL 1%的多聚甲醛重懸，上流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）檢測，進行流式檢測。

1.3 統計學分析 應用SPSS 11.0軟件處理，數據用均數±標準差表示，組間比較用單因素方差分析（ANOVA），變量間用Spearman相關分析，P＜0.05為有差異有統計學意義。

2 結果

MCAO 組外周血中CD4＋CD25＋調節性T 細胞的表達在模型制備后24h、72h時與假手術組比較差異無統計學意義（P＞0.05），在1周、2周時明顯高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同時間水平之間CD4＋CD25＋調節性T 細胞的表達有顯著差異性（P＜0.05）。見表1。梗死后的24h、72h、1周、2周CD4＋CD25＋調節性T 細胞的表達逐漸增高，而假手術組表達相對保持恒定，無顯著變化趨勢。不同組別的表達有顯著差異性，MCAO 組明顯高于假手術組（P ＜0.01）。時 間 與 分 組 之 間 有 顯 著 交 互 效 應（P ＜0.01），但變化趨勢不同。見表2。

表1 2組不同時期CD4＋CD25＋調節性T 細胞的表達 ［n（%）］

表2 CD4＋CD25＋調節性T 細胞表達的時間和分組效應分析 ［n（%）］

3 討論

腦梗死日益呈增長及年輕化趨勢，致殘率和病死率逐年增高，嚴重威脅人們健康和生命。已經證實腦梗死后的炎癥反應會加重顱腦受損部位的腦損傷，甚至有人認為腦內過度表達的炎性反應對病灶區腦組織的損傷比缺血本身更嚴重。所以對過度表達的炎性反應的抑制，越來越受到人們的關注和研究。近年來，多個課題組通過對外周免疫的大量研究證實，CD4＋CD25＋調節性T 細胞對其維持起重要作用。隨著對CD4＋CD25＋調節性T 細胞在體內、外具體機制的深入研究，已經證實其具有免疫抑制性和免疫無能性兩大特征。而其具有的對效應性T 細胞的抑制特性，使其在腦梗死后的機制成為近期研究的熱點。

研究表明，炎癥因子和趨化因子在腦梗死后增高，腦梗死后缺血灶周圍活躍的炎癥反應，如細胞因子、趨化因子、內皮細胞黏附分子和蛋白酶的活動等，會加重腦組織損傷［2］，CD4＋CD25＋調節性T 細胞主要在機體免疫中通過復雜的作用機制維持外周免疫耐受，限制效應細胞的應答程度，從而防止過度免疫反應所致的組織損傷，發揮負向調節作用。Brusko等［3－4］認為，CD4＋CD25＋調節性T 細胞具有免疫抑制作用，既可抑制CD4＋和CD8＋效應性細胞介導的免疫反應，也可抑制樹突狀細胞和自然殺傷細胞的功能，可有效抑制反應性T 細胞的增殖和細胞因子分泌，繼而可能改善腦梗死的結果。CD4＋CD25＋調節性T 細胞可能在梗死后神經功能的再生和修復中起重要作用。

本實驗發現，不同時間點隨著CD4＋CD25＋調節性T 細胞的表達增多，表明CD4＋CD25＋調節性對腦梗死有潛在的腦保護作用，但具體機制仍不清楚，仍需進一步研究。

［1］ Offner H，Vandenbark AA，Hum PD.Effect of experimental stroke on peripheral immunity：CNS ischemia induces profound immunosuppression［J］.Neuroscience，2009，158（3）：1 098－1 111.

［2］ Gee JM，Kalil A，Shea，C，et al.Lymphoeytes：pomntial mediators of postischemic injury and neuroprotection［J］.Stroke，2007，38（2Suppl）：783－788.

［3］ Brusko TM，Hulnk MA，Myhr CB，et al.Assessing the in vitro suppressive capacity of regulatory T cells［J］.Immunol Invest，2007，36（3／5）：607－628.

［4］ Cuenca－López MD，Biea D，Galindo MF.Inf1ammatory response during ischemic processes：adhesion molecu1es and immunomodulation［J］.Rev Neurol，2010，51（1）：30－40.