樺樹皮中白樺脂酸和白樺脂醇的提取與含量測(cè)定

陸靜等

【摘 要】目的：建立樺樹皮中白樺脂酸和白樺脂醇的提取和含量測(cè)定方法。方法：對(duì)比了索氏提取和超聲提取方法，采用HPLC-UV方法測(cè)定含量，固定相為COSMOSIL5 C18 柱（4.6ID*250mm），流動(dòng)相為甲醇—0.1%甲酸（80：20），流速1.0（ml/min），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。結(jié)果：采用索氏提取法所得的提取物中白樺脂酸和白樺脂醇含量比超聲提取物更高，所建立的HPLC法快速準(zhǔn)確，能用于樺樹皮中白樺脂酸和白樺脂醇的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】樺樹皮；白樺脂酸；白樺脂醇

天然藥物樺樹皮為樺樹科植物白樺（Betula platyphylla Suk）的柔軟樹皮，具有清熱利濕，解毒之功效。白樺樹皮在抗腫瘤、抗炎和抗氧化等方面表現(xiàn)出了巨大的潛能，并顯示出與以往藥物不同的作用機(jī)制。樺樹皮中的主要活性成分白樺脂醇和白樺脂酸（結(jié)構(gòu)式見圖1）都是羽扇烷型三萜類化合物[1-2]。尤其是白樺脂酸，具有廣譜的生物學(xué)以及藥理學(xué)活性，在抗腫瘤方面有很大的潛力，能選擇性殺死人類黑色素瘤細(xì)胞而不殺傷健康細(xì)胞[3-5]。據(jù)李薇等的文獻(xiàn)報(bào)道，白樺樹皮中提取得到的三萜類物質(zhì)（TBP），包括白樺脂酸、白樺脂醇、白樺烯三醇、羽扇豆醇等，它們都具有良好的抗腫瘤作用。0.89g/kg和1.2g/kg的TBP對(duì)目標(biāo)瘤株的抑瘤作用均達(dá)到30%以上，其中對(duì)黑色素瘤B16的抑瘤作用最強(qiáng)，1.2g/kg的TBP的抑瘤率達(dá)到50%以上[6]。

白樺脂醇也屬羽扇烷型三萜類化合物，雖然也具有一定藥理活性和應(yīng)用價(jià)值，但生物活性不高?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與白樺脂酸的差別在于C-28位取代基不同，而C-28取代基的類型對(duì)其抗腫瘤活性有較強(qiáng)的影響，這也是白樺脂醇抗腫瘤活性不及白樺脂酸的原因[7]。白樺脂醇無(wú)毒，具有抗腫瘤、消炎、抗過(guò)敏等功效，在食品、醫(yī)藥、日用化工領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[8]。故以其為先導(dǎo)化合物，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，構(gòu)建分子多樣性的衍生物庫(kù)，以獲得高活性化合物具有重要的研究意義和價(jià)值。國(guó)外學(xué)者對(duì)樺木屬植物在化學(xué)、藥理及開發(fā)利用方面進(jìn)行過(guò)較多研究，證實(shí)白樺脂酸才是樺樹皮的重要生物活性成分[9，10]。

本研究對(duì)比索氏提取和超聲提取兩種方法分別提取樺樹皮，并采用HPLC-UV方法測(cè)定其中白樺脂酸和白樺脂醇的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

ME104 /02型電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；arilum pro DI超純水系統(tǒng)（德國(guó)賽多利斯公司）；VORTE-GENIE 2型旋渦混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；Agilent 1260型高效液相色儀（安捷倫Agilent）；SB-5200D超聲波清洗器（寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司）；N-1100V-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；四兩裝高速中藥粉碎機(jī)（廈門旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）；PL203電子分析天平（梅特勒—托利多儀器上海有限公司）；OSB—2100油浴鍋（上海愛(ài)朗儀器有限公司）

1.2 試劑

樺樹皮藥材購(gòu)自大興安嶺，對(duì)照品白樺脂酸（批號(hào)130920，四川省維克奇生物科技有限公司）、對(duì)照品白樺脂醇（批號(hào)130914，四川省維克奇生物科技有限公司），甲酸、甲醇、DPPH、乙醇為分析純，水為雙蒸水，HP LC甲醇為色譜純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)試用性試驗(yàn)

Agilent 1260型高效液相色儀；色譜柱：COSMOSIL5C18-MS-Ⅱ（4.6ID*250mm）Manf.No.K66428；流動(dòng)相：甲醇—0.2%甲酸（85：15）；流速：1.0（ml/min）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20ul；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。按上述色譜條件進(jìn)樣，白樺脂酸和白樺脂醇與相鄰峰的分離度皆大于1.5，理論板數(shù)按白樺脂酸峰和白樺脂醇峰皆大于3000，符合測(cè)定要求。

2.2 供試品溶液配制

2.2.1 超聲提取法供試品溶液的配制

精密稱取干燥的樺樹皮粗粉5g，于100ml甲醇中超聲提取3次，每次20min。濾過(guò)，合并3次濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其濃縮近干。將濃縮后樣品轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中用甲醇定容至刻度。

2.2.2 索氏提取法供試品溶液的配制

精密稱取干燥的樺樹皮粗粉5g，以甲醇為提取溶劑，于索氏提器中水浴恒溫85℃提取3次，每次60min。濾過(guò)，合并3次濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其濃縮近干。將濃縮后樣品轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中用甲醇定容至刻度。

2.3 對(duì)照品溶液配制

稱取白樺脂酸對(duì)照品11.21mg和白樺脂醇對(duì)照品9.69mg，用甲醇溶解于50ml容量瓶中定容至刻度，得0.2242mg/ml白樺脂酸對(duì)照品，0.1938mg/ml白樺脂醇對(duì)照品。在相同操作下，精密配制濃度為3.681mg/ml白樺脂醇對(duì)照品溶液，1.136mg/ml白樺脂酸對(duì)照品溶液后混合，精密吸取混合對(duì)照品溶液5.00ml、2.50ml、1.25ml、0.63ml、0.31ml分別置于10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，得濃度為0.6-0.03mg/ml白樺脂酸和2.0-0.1mg/ml白樺脂醇的一系列對(duì)照品溶液，作線性范圍考察。

2.4 線性范圍考察

按2.3項(xiàng)下線性考察對(duì)照品配制方法，在2.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：白樺脂酸Y=5618.3X+107.71，r=0.9992；白樺脂醇Y=6578.6X+77.11，r=0.9994。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取2.3項(xiàng)下0.2242mg/ml白樺脂酸對(duì)照品，0.1938mg/ml白樺脂醇對(duì)照品溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算 RSD，白樺脂酸、白樺脂醇RSD分別為：結(jié)果白樺脂酸、白樺脂醇RSD分別為0.41%和0.44%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取索氏提取的一個(gè)樣品，分別于0，1，2，4，8，12，24h進(jìn)樣，考察穩(wěn)定性，結(jié)果供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定，白樺脂酸、白樺脂醇RSD分別為：1.6%、1.2%。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取白樺脂酸和白樺脂醇對(duì)照品，加入甲醇配制成白樺脂酸0.18，0.36，0.54mg/ml，白樺脂醇0.14，0.28，0.42mg/ml，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得，取20μL進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算高中低三個(gè)濃度回收率。結(jié)果平均回收率為98.80%，RSD為1.5%

2.8 樣品含量測(cè)定

取2.2.1和2.2.2項(xiàng)下兩份供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析色譜圖見圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

3 討論

由圖1與表1，表2可知索氏提取的樣品峰面積均大于超聲提取的對(duì)應(yīng)峰面積，超聲提取白樺脂酸C（mg/ml）=0.4910，白樺脂醇C（mg/ml）=3.1464索氏提取白樺脂酸C（mg/ml）=0.5825，白樺脂醇C（mg/ml）=3.6737，所以索氏提取樺樹皮中的白樺脂酸和白樺脂醇的效果優(yōu)于超聲提取法，故采用索氏提取法進(jìn)行提取。

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[責(zé)任編輯：湯靜]